كفاءة الإنتاج البارفو المؤتلف مع مساعدة من اتش المستمدة من الأنظمة
Summary
نحن هنا وصفا لبروتوكول يستند فقط على إصابة الخلية، مما يحسن من كفاءة الإنتاج البارفو المؤتلف من قبل أكثر من 100 أضعاف بالمقارنة مع غيرها من البروتوكولات في الاستخدام. هذا البروتوكول يعتمد على استخدام اتش 5 رواية القائم على المساعد الذي يحتوي على نسخ نائب رئيس وحدة البارفو (AD-VP).
Abstract
parvoviruses القوارض (PV) مثل جرذ H-1PV وMVM، صغيرة، واحد متعدد السطوح الذين تقطعت بهم السبل الحمض النووي الفيروسات،. الجينوم الخاصة بهم تضم اثنين من المروجين P4 و P38 التي تنظم التعبير عن البروتينات غير الهيكلية (NS1 وNS2)، وقفيصة (VP1 وVP2) على التوالي 1. وهي تجتذب اهتماما كبيرا كعوامل مضادة للسرطان لقدراتهم وoncolytic oncosuppressive في حين يجري غير ممرضة للبشر 2. NS1 هو المستجيب الرئيسية من 3 السمسة الفيروسية. من أجل تعزيز أنشطتها موانع الأورام الطبيعية، وقد ولدت هذه المشتقات من ناقلات عن طريق استبدال الجين الترميز لالبروتينات قفيصة مع التحوير العلاجية (مثل ببتيد السامة للخلايا، خلوى، chemokine الجينات السرطانية، القامع الخ) 4. وparvoviruses المؤتلف (recPVs) ناقلات يحتفظ تسلسل NS1 / 2 الترميز والتيلومير الجينوم الكهروضوئية التي تعتبر ضرورية لتضخيم الحمض النووي الفيروسي والتعبئة والتغليف. إنتاجrecPVs لا يحدث إلا في الخلايا المنتجة (HEK293T عموما)، التي شاركت في transfecting الخلايا مع ناقل الثانية (pCMV-VP) معربا عن ترميز الجين للبروتينات نائب الرئيس (الشكل رقم 1) 4. ناقلات recPV ولدت في هذه الطريقة هي تكرار معيب. على الرغم من أن recPVs ثبت لامتلاك الأنشطة oncotoxic المعززة فيما يتعلق الفيروسات من الوالدين والتي تم إنشاؤها فيها، إنتاجها لا يزال يشكل تحديا كبيرا ويعرقل بشدة استخدام هذه العوامل المضادة للسرطان في التطبيقات السريرية.
وجدنا أن إدخال متجه الإعلان-5 المشتقة التي تحتوي على E2A، E4 (orf6) والحمض النووي الريبي الجينات زارة شؤون المحاربين القدامى (على سبيل المثال pXX6 البلازميد) في HEK293T تحسن الإنتاج من recPVs بأكثر من 10 ضعفا بالمقارنة مع غيرها من البروتوكولات في الاستخدام. استنادا إلى هذه النتيجة، لقد وضعنا رواية AD-VP-المساعد الذي يحتوي على العناصر الجينية الفيروسة الغدانية اللازمة لتعزيز الإنتاج recPVs فضلا عن parvovir فيلنا وحدة الجينات نائب الرئيس 5. استخدام AD-VP-المساعد، ويسمح إنتاج تفصيل، المحاضر الحرفية باستخدام بروتوكول الذي يعتمد كليا على خطوات عدوى فيروسية (على العكس من ترنسفكأيشن البلازميد)، مما يجعل من الممكن استخدام خطوط الخلايا التي يصعب transfect (على سبيل المثال NB324K) ( الشكل 2). نقدم أسلوب الذي يحسن كثيرا من كمية الفيروس المؤتلف المنتجة، والحد من كل من وقت الإنتاج والتكاليف، دون التأثير على جودة المنتج النهائي 5. وبالإضافة إلى ذلك، الانتاج على نطاق كبير من recPV (في الخلايا التعليق والمفاعلات الحيوية) هي الآن يمكن تصوره.
Protocol
Discussion
لقد أظهرنا أنه يمكن تعزيز recPV الإنتاج من خلال وجود عناصر الجينومية الفيروسة الغدانية. لقد قمنا بزيادة الغلة recPV بأكثر من 10 ضعفا (0،3-5 خلية / TU) من خلال تقديم اتش العنصر الجيني عبر ترنسفكأيشن وأكثر من 100 أضعاف الخلايا المشارك اصابة مع AD-VP-المساعد في تركيبة مع recPV في بالمقار…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر فريق من إنتاج فيروس DKFZ وحدة التطوير، في ماركوس مولر وجه الخصوص، Münstermann سيلفيا، Liebetrau باربارا، وRoscher ماندي. وقد دعمت هذه الدراسة جزئيا من المنح المقدمة من الوزارة الاتحادية للتعليم والبحوث (BMBF) ومؤسسة هيلمهولتس في إطار Krebsforschungszentrum الألماني / Cancéropôle دو غراند مؤسسة برنامج مشترك في الأورام التطبيقية علم الفيروسات.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| DMEM | Sigma | D5796 |
| MEM | Sigma | M4655 |
| Foetal Bovine Serum | PAA | A15-101 |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-024 |
| Fugene | Roche | 047097050001 |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25300062 |
| Benzonase Nuclease | Sigma | E8263 |
| Adeno-X Rapid Titer Kit | Clontech | 632250 |
References
- Cotmore, S. F., Tattersall, P. Parvoviral host range and cell entry mechanisms. Adv. Virus. Res. 70, 183 (2007).
- Rommelaere, J. Oncolytic parvoviruses as cancer therapeutics. Cytokine Growth Factor Rev. 21, 185 (2010).
- Hristov, G. Through Its Nonstructural Protein NS1, Parvovirus H-1 Induces Apoptosis via Accumulation of Reactive Oxygen Species. J. Virol. 84, 5909-5909 (2010).
- Cornelis, J. J., Salome, N., Dinsart, C., Rommelaere, J. Vectors based on autonomous parvoviruses: novel tools to treat cancer. J. Virol. 6, 193-193 (2004).
- El-Andaloussi, N. Novel adenovirus-based helper system to support production of recombinant parvovirus. Cancer Gene Ther. 18, (2011).
- Kestler, J. cis requirements for the efficient production of recombinant DNA vectors based on autonomous parvoviruses. Hum. Gene. Ther. 10, 1619-1619 (1999).
- Xiao, X., Li, J., Samulski, R. J. Production of high-titer recombinant adeno-associated virus vectors in the absence of helper adenovirus. J. Virol. 72, 2224 (1998).
- He, T. C. A simplified system for generating recombinant adenoviruses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 2509 (1998).
- Zolotukhin, S. Recombinant adeno-associated virus purification using novel methods improves infectious titer and yield. Gene. Ther. 6, 973 (1999).
- Maxwell, F., Harrison, G. S., Maxwell, I. H. Improved production of recombinant AAV by transient transfection of NB324K cells using electroporation. J. Virol. Methods. 63, 129 (1997).
- Wrzesinski, C. Chimeric and pseudotyped parvoviruses minimize the contamination of recombinant stocks with replication-competent viruses and identify a DNA sequence that restricts parvovirus H-1 in mouse cells. J. Virol. 77, 3851 (2003).
