Modificato lievito-sistema del doppio ibrido per identificare proteine ​​che interagiscono con il fattore di crescita progranulina

Summary

Abbiamo modificato il lievito tradizionale doppio ibrido di screening, un efficace strumento genetico per identificare interazioni proteiche. Questa modifica riduce notevolmente il processo, riduce il carico di lavoro e, soprattutto, riduce il numero di falsi positivi. Inoltre, questo approccio è riproducibile ed affidabile.

Abstract

Progranulina (PGRN), noto anche come precursore granulin epithelin (GEP), è un fattore 593-amino-acido crescita autocrino. PGRN è nota per svolgere un ruolo critico in una varietà di processi fisiologici e malattie, tra cui l'embriogenesi precoce, la guarigione della ferita ^1, infiammazioni ^{2, 3,} e ospitare difesa ^4. PGRN funziona anche come un fattore neurotrofico ^5, e le mutazioni nel gene PGRN con conseguente perdita parziale della proteina causano demenza frontotemporale PGRN ^{6, 7.} I nostri studi recenti hanno portato all'isolamento di PGRN come un importante regolatore di sviluppo della cartilagine e del degrado ^8-11. Anche se PGRN, scoperto quasi due decenni fa, gioca un ruolo cruciale in molteplici condizioni fisiologiche e patologiche, gli sforzi per sfruttare le azioni di PGRN e comprendere i meccanismi coinvolti sono stati significativamente ostacolata dalla nostra incapacità di identificare il suo legame al recettore (s). Per risolvere questo problema, abbiamo sviluppato un modicato doppio ibrido di lievito (MY2H) approccio basato sulla più comunemente utilizzati GAL4 base 2-sistema ibrido. Rispetto al tradizionale doppio ibrido di lievito schermo, MY2H riduce drasticamente il processo di schermo e riduce il numero di cloni falsi positivi. Inoltre, questo approccio è riproducibile e affidabile, e abbiamo impiegato con successo questo sistema per isolare le proteine ​​leganti di esche, tra cui ioni di canale ^12, proteine ​​della matrice extracellulare ^{10, 13,} e del fattore di crescita ^14. In questo lavoro, si descrive questa procedura MY2H sperimentale in dettaglio utilizzando PGRN come un esempio che ha portato alla identificazione di TNFR2 come la prima nota PGRN associata recettore ^{14, 15.}

Protocol

1. Informazioni di base Il sistema del doppio ibrido di lievito è una potente tecnica genetica utilizzata per scoprire interazioni proteina-proteina 16, 17. Diversi tipi di 2-sistemi ibridi, come i sistemi basati su lexa, il sistema di reclutamento Sos, e batteri o cellule di mammifero a base di 2-ibridi, sono commerciali disponibili, questo articolo si concentra in particolare sulle modifiche dei più comunemente usati GAL4 base lievito 2-sistema ibrido. In breve, il metodo si bas…

Discussion

Doppio ibrido di lievito di screening ha dimostrato di essere uno strumento efficace per identificare interazioni proteina ^{16, 17.} Rispetto ad altri approcci per identificare le proteine ​​di legame partner, come la biochimica di co-purificazione e proteine ​​chip, lievito sistema del doppio ibrido è un approccio sensibile genetico che può essere utilizzato per lo screening numero molto elevato di sequenze codificanti in un esperimento relativamente semplice, in Inoltre, rileva l'interazione in …

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
ProQuest two-hybrid system	Invitrogen	10835
YPD Growth Medium	Clontech	630409
YPD Agar Medium	Clontech	630410
Minimal SD agar Base	Clontech	630412
-Leu DO Supplement	Clontech	630414
-Leu/-Trp DO Supplement	Clontech	630417
-His/-Leu/-Trp/-Ura DO Supplement	Clontech	630425
3-Amino-1,2,4-Triazole (3AT)	Sigma-Aldrich	A8056
Luria broth (LB)	Sigma-Aldrich	L3022
X-Gal	Invitrogen	15520-034
Sonicated Salmon Sperm DNA	Stratagene	201190
Ampicillin	AMRESCO	0339
Kanamycin Sulfate	Invitrogen	11815-024
Subcloning Efficiency™ DH5α™ Competent Cells	Invitrogen	18265-017
Trizma® base	Sigma-Aldrich	T6066
Lithium acetate	Sigma-Aldrich	L4158
Ethylenediaminetetraacetic acid	Sigma-Aldrich	ED
Nitrocellulose Membrane	Bio-Rad	162-0115
10-cm petri dish	ITI Scientific	CT-903
Incubator (30 °C)	ATR (Ecotron)