Mise à jour de levure-système à deux hybrides pour identifier les protéines qui interagissent avec le facteur de croissance progranuline
Summary
Nous avons modifié la levure classique double-hybride en dépistage, un outil efficace dans l'identification génétique d'interactions protéiques. Cette modification raccourcit nettement le processus, réduit la charge de travail, et surtout, réduit le nombre de faux positifs. En outre, cette approche est reproductible et fiable.
Abstract
Progranuline (PGRN), aussi connu comme granulin epithelin précurseurs (GEP), est un facteur de croissance 593 acides aminés autocrine. PGRN est connue pour jouer un rôle critique dans une variété de processus physiologiques et les maladies, y compris l'embryogenèse précoce, une cicatrisation, l'inflammation 2, 3 et 4 défense de l'hôte. PGRN fonctionne également comme un facteur neurotrophique 5, et des mutations dans le gène PGRN résultant en une perte partielle de la démence frontotemporale PGRN provoquer des protéines 6, 7. Nos études récentes ont conduit à l'isolement du PGRN comme un régulateur important du développement du cartilage et de la dégradation 8-11. Bien PGRN, découvert près de deux décennies auparavant, joue un rôle crucial dans de multiples conditions physiologiques et pathologiques, les efforts pour exploiter les actions du PGRN et de comprendre les mécanismes impliqués ont été considérablement entravés par notre incapacité à identifier ses liaison au récepteur (s). Pour répondre à cette question, nous avons développé une modiFied deux hybrides de levure (MY2H) approche fondée sur le plus couramment utilisé GAL4 base 2-hybride. Comparé avec les deux hybrides de levure écran conventionnel, MY2H raccourcit considérablement le processus de l'écran et réduit le nombre de faux clones positifs. En outre, cette approche est reproductible et fiable, et nous avons utilisé avec succès ce système à isoler les protéines de liaison d'appâts différents, y compris les canaux ioniques 12, protéine de la matrice extracellulaire 10, 13 et 14 du facteur de croissance. Dans cet article, nous décrivons cette procédure expérimentale MY2H en détail en utilisant PGRN comme un exemple qui a conduit à l'identification de TNFR2 que le premier connu PGRN-récepteur associé 14, 15.
Protocol
Discussion
Deux hybrides de levure de dépistage s'est avéré être un outil efficace dans l'identification des interactions protéine 16, 17. Comparé à d'autres approches pour identifier les protéines liant les partenaires, tels que biochimiques co-purification de protéines et de puces, deux hybrides de levure système est une approche sensible génétiques qui peuvent être utilisés pour le dépistage très grand nombre de séquences codantes dans une expérience relativement simple, dans De plus, il…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été financé par des subventions de recherche des NIH K01AR053210, R01AR061484 et une subvention du National Psoriasis Foundation.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| ProQuest two-hybrid system | Invitrogen | 10835 |
| YPD Growth Medium | Clontech | 630409 |
| YPD Agar Medium | Clontech | 630410 |
| Minimal SD agar Base | Clontech | 630412 |
| -Leu DO Supplement | Clontech | 630414 |
| -Leu/-Trp DO Supplement | Clontech | 630417 |
| -His/-Leu/-Trp/-Ura DO Supplement | Clontech | 630425 |
| 3-Amino-1,2,4-Triazole (3AT) | Sigma-Aldrich | A8056 |
| Luria broth (LB) | Sigma-Aldrich | L3022 |
| X-Gal | Invitrogen | 15520-034 |
| Sonicated Salmon Sperm DNA | Stratagene | 201190 |
| Ampicillin | AMRESCO | 0339 |
| Kanamycin Sulfate | Invitrogen | 11815-024 |
| Subcloning Efficiency™ DH5α™ Competent Cells | Invitrogen | 18265-017 |
| Trizma® base | Sigma-Aldrich | T6066 |
| Lithium acetate | Sigma-Aldrich | L4158 |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | ED |
| Nitrocellulose Membrane | Bio-Rad | 162-0115 |
| 10-cm petri dish | ITI Scientific | CT-903 |
| Incubator (30 °C) | ATR (Ecotron) |
References
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