세포 융합의 탐지를위한 Cre - 훈제 연어 P 재조합 접근법 VIVO에서</em
Summary
시간이 지남에 따라 생물을 생활에 세포 융합을 추적하는 방법을 설명합니다. 접근 이용 Cre -를<em> LoxP</em> 재조합은 세포 융합에 루시페라제 표현을 유도합니다. 생성되는 발광 신호는 주변 조직의 ~ 1,000 세포의 검출의 감도와 biophotonic 이미징 시스템을 사용하여 살아있는 생물에서 발견하실 수 있습니다.
Abstract
퓨즈에 같은 종류의 두 개 이상의 세포의 기능은 골격근, 뼈 및 태반 등 많은 복잡한 장기를 형성하기 위해 진화를 통해 metazoans에서 널리 사용되었습니다. 현대 연구는 같은 종류의 세포 융합 향상된 기능을 수여 보여줍니다. 예를 들어, 태반 퓨즈의 trophoblast 세포가 syncytiotrophoblast을 형성하면 syncytiotrophoblast 더 unfused trophoblasts 1-4보다 모성 – 태아 장벽에 걸쳐 영양소와 호르몬을 수송 수 있습니다. 최근 연구는 다른 종류의 세포 융합 세포의 운명을 직접 보여준다. 융합에 의한 "복귀"또는 세포 운명의 수정은 한 번 세포 배양 시스템에 국한 것으로 생각되었다. 그러나 줄기 세포 이식의 출현은 우리에 의해 발견 LED와 줄기 세포를 다른 생체내의 체세포와 퓨즈 수 있으며 그 융합은 줄기 세포 분화가 5-7 용이하게합니다. 따라서, 세포 융합은 규제 프로세스는 C따라서 세포 생존과 분화를 촉진의 apable 및 개발, 조직의 수리도 질병의 pathogenesis에 대한 중앙의 중요성 수 있습니다.
적절한 기술의 부족)가 1, 세포 융합의 연구는 제한하는 것은 정확하게 시간이 지남에 따라) 트랙 융합 제품을 융합 제품을 식별하고 2. 여기에 우리가 퓨전시 bioluminescence의 유도 (그림 1)를 통해 모두 한계를 해결하기 위해 새로운 접근 방식을 제시,. bioluminescence는 생체내 8-15 높은 감도로 감지할 수 있습니다 우리는 반딧불 루시페라제 인코딩 구조를 활용 (Photinus pyralis) 유전자에 인접한 위치 정지 코돈은 LoxP 시퀀스의 어귀. Cre recombinase 단백질을 표현하는 세포이 유전자 퓨즈를 표현 세포, LoxP 사이트가 죽습하고 정지 신호 루시페라제의 전송을 허용 excised하는 것입니다. 신호가 induci이기 때문에경, 거짓 – 긍정적인 신호의 발병률은 매우 낮은 것입니다. Cre / LoxP 시스템 16, 17를 사용하는 기존의 방법과는 달리, 우리는 "살아있는"감지 신호를 통합하고이를 처음 생체내의 세포 융합의 속도론을 추적할 수있는 기회를 감당할.
접근 방식을 보여주기 위해, ubiquitously Cre recombinase을 표현 쥐가 floxed 중지 코돈의 루시페라제 스트림을 표현하는 구조로 transfected 줄기 세포의 수신자을 역임했습니다. 줄기 세포는 intramyocardial 주입을 통해 이식되었으며 이식 intravital 이미지 분석의 존재를 추적하기 위해 실시 후 시간이지나면서 심장과 주변 조직의 융합 제품. 이러한 접근 방식은 개발, 질병 또는 성인 조직 복구의 모든 단계에서 모든 조직 유형의 세포 융합을 분석 적응 수 있습니다.
Protocol
Discussion
방법은 작은 동물을 포함하여 생물에서 처음으로, 수 여기에 세포 융합의 개별 식별 및 시간적 분석을 설명했다. 접근 방식은 이후 biophotonic 이미지 분석 Cre – LoxP 재조합을 결합한 제품입니다. 접근 방식은 세포 – 세포 융합뿐만 아니라 추적 의무가있다,뿐만 아니라 바이러스 세포 융합 등 바이러스 감염을 추적하기위한 유용 수 있습니다. 이미지 분석은 신속하고 그것은 동시에 이미지를 여러 작?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 아낌없이 H1 MSCS, 박사 팀의 해커 박사 Gouqing 노래와 위스콘신 순환기 생리학 대학의 양 질 코흐를 제공하는 박사 Peiman Hemmati을 (의학 계열, 위스콘신 – 매디슨 대학) 감사하고 싶습니다 마우스 수술을 수행하기위한 핵심 시설. 이 작품은 브라이언 프리맨과 NIH R21 HL089679에 대학원 연구 활동을 통해 국립 과학 재단 (National Science Foundation)에 의해 지원되었다.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Neon Transfection System | Invitrogen, Carlsbad, CA | MPK5000 | |
| Neon 100 μL Kit | Invitrogen, Carlsbad, CA | MPK10025 | Contains R and E Buffer |
| a-MEM powder | Invitrogen, Carlsbad, CA | 12000-022 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone, Logan UT | SH30070.03 | |
| B6.C-Tg(CMV-cre)1Cgn/J | Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME | 006054 | |
| Trypsin 10X | Fisher Scientific, Forest Lawn, NJ | MT-25-054-Cl | |
| L-Glutamine | Fisher Scientific, Forest Lawn, NJ | 25030-081 | |
| D-Luciferin | Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA | 122796 | |
| Xenogen Biophotonic Imaging System | Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA | IVIS Spectrum | |
| Sodium Biocarbonate | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | S6014-500G | |
| Non-essential Amino Acids | Invitrogen, Carlsbad, CA | 11140-050 |
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