MALDI-TOF espectrometría de masas fue utilizada con éxito para controlar la amida hidrógeno / deuterio cambio en la activación de proteína quinasa Pak2.
Amida de hidrógeno / deuterio intercambio (H / D intercambio) acoplada a espectrometría de masas ha sido ampliamente utilizado para analizar la interfaz de las interacciones proteína-proteína, los cambios conformacionales de proteínas, dinámica de las proteínas y las interacciones ligando-proteína. H / D intercambio de las posiciones de columna vertebral amida se ha utilizado para medir las tasas de deuteración de las micro-regiones de una proteína por espectrometría de masas 1,2,3. La resolución de este método depende de la digestión con pepsina de la proteína de interés deuterado en péptidos que normalmente rango 3-20 residuos. Aunque la resolución de H / D intercambio medido por espectrometría de masa es menor que la resolución solo residuo medido por el heteronuclear único coherencia cuántica (HSQC) el método de RMN, espectrometría de masas de la medición de H / D intercambio no estará limitado por el tamaño de la proteínas 4. H / D intercambio se lleva a cabo en una solución acuosa que mantiene la conformación de proteínas. Ofrecemos un método que utilriza el MALDI-TOF para la detección de dos, en lugar de un sistema HPLC / ESI (ionización electrospray)-MS 5,6. El MALDI-TOF ofrece datos precisos sobre la intensidad de la masa de los péptidos de la proteína digerida, en este caso quinasa Pak2 proteína (también llamada γ-Pak). La proteólisis de Pak 2 se lleva a cabo en una digestión de la pepsina en línea. Este método alternativo, cuando el usuario no tiene acceso a una columna de HPLC y la pepsina conectado a la espectrometría de masas, o cuando la columna de la pepsina en HPLC no se traduce en un mapa de una digestión óptima, por ejemplo, la muy unidas por puentes disulfuro secreta fosfolipasa A 2 (sPLA2). Utilizando este método, hemos logrado controlar los cambios en el nivel deuteración durante la activación de la caspasa 3 Pak2 por división y la autofosforilación 7,8,9.
Identificación de los fragmentos digeridos con pepsina es un paso crítico de la experiencia de H / D intercambio. Una incorrecta identificación de los péptidos puede llevar a una conclusión equivocada. Pak2 pepsina digerida se eluye a través de una columna HPLC en fase reversa C18 para obtener un fondo limpio. En nuestros experimentos, un total de 40 fracciones fueron recogidos y sometidos a MALDI-TOF. Múltiples péptidos podrían ser identificados en cada una de las fracciones. Los péptidos fueron sometidos a espectrometría de masas tándem (Q-TOF MS / MS y oMALDI MS / MS) para identificar sus secuencias. Los espectros MS / MS de un péptido debe tener al menos tres iones producto para confirmar la identificación de los péptidos.
El Explorador de Datos programa de ordenador 4.0 (Applied Biosystems) realiza la corrección de línea de base inicial y filtración de ruido. Cada espectro deberá ser calibrado a partir de dos picos en secuencia. Calibramos nuestro espectro de la masa teórica de la undeuterated m / z que son 923,45 y 1.697,84. Tél precisión la masa después de la calibración puede llegar a 10 ppm. Al deuteración, el mono-isótopo puede cambiar a una masa mayor. Aumenta unitaria paso a estas relaciones m / z dado a las masas asociadas a una mayor deuteración. El pico de intensidad de la envoltura de masa no afectará el nivel de deuteración. Sin embargo, las intensidades de los picos isotópicos en un sobre de masas en particular son esenciales para el cálculo de la masa media. El primer paso para el cálculo del deuterón incorporado es restar la masa de péptidos de la muestra no deuterado de la muestra deuterado. Hay otros tres factores, el D 2 O de dilución, los deuterones residual en las cadenas laterales y el intercambio de nuevo, tendrá que ser consideradas en el cálculo (Figura 1). La dilución D 2 O es el factor de dilución de D 2 O después de mezclar la muestra y D 2 O de amortiguación para iniciar el intercambio H / D. El deuterón residual (4,5%) en las cadenas laterales de la pepsina de digerirpéptidos ed tiene que restarse. La parte posterior de intercambio es la inevitable pérdida de deuteración en todos los péptidos deuterado y la pepsina digerida en el proceso de medición de la masa.
El péptido más accesible disolvente (m / z = 1105,60) después de 24 horas de H / D intercambio representa una región deuteración completo. El número deuterón incorporados para cada uno de los péptidos es la diferencia entre el centro de gravedad de los péptidos péptica deuterados y no deuterados-Pak2. Los más deuterado péptido m / z 1105 fue seleccionado para representar deuteración completa cuando Pak2 fue a las 24 horas de H / D intercambio. La Ecuación de Canje Volver fue calculado por el número real de deuterio incorporado a las 24 horas de H / D intercambio dividido por todos los sitios posibles canjeables en péptido m / z 1105.
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo es apoyado en parte por los Institutos Nacionales de Salud Grant GM-26738 (a JAT).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
D2O | Aldrich | 7789-20-0 | |
α-cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma | 28166-41-8 | |
MALDI-TOF | PE Biosystems | Voyager DE STR | |
Q-TOF mass spectrometer | Q-TOF Ultima-Global | ||
QSTAR XL oMALDI MS/MS | Applied Biosystems | ||
Data Explorer 4.0 computer program | Applied Biosystems |