MALDI – TOF質量分析法は、正常にプロテインキナーゼPAK2活性化のアミド水素/重水素交換を監視するために利用された。
質量分析法と相まってアミド水素/重水素交換(H / D交換)が広くタンパク質 – タンパク質相互作用、タンパク質立体構造の変化、タンパク質のダイナミクスとタンパク質 – リガンド相互作用のインターフェースを分析するために使用されています。バックボーンアミドポジションのH / D交換は、質量分析法1,2,3によってタンパク質のマイクロの領域の重水素化率を測定するために利用されている。この方式の分解能は、通常30から20残基の範囲であるペプチドへの関心の重水素化タンパク質のペプシン消化によって決まります。質量分析法により測定されたH / D交換の決議は、NMRの異種単量子コヒーレンス(HSQC)法で測定した1残基の解像度よりも低いですが、H / D交換の質量分析の測定は、のサイズによって制限されていませんタンパク質4。 H / D交換は、タンパク質の立体構造を維持する水溶液中で実施される。我々は、util、そのメソッドを提供する代わりに、HPLC / ESI(エレクトロスプレーイオン化)- MSシステム5,6の検出2のMALDI – TOFを、izes。 MALDI – TOFは、この場合プロテインキナーゼPAK2(また、γ- PAKと呼ばれる)で、消化タンパク質のペプチドの精密質量の強度データを提供します。パック2のタンパク質分解は、オフラインペプシン消化で行われる。ユーザーは、質量分析に接続されているHPLCおよびペプシン列へのアクセス権を持っていない、またはHPLCでのペプシンの列には、例えば、最適な消化のマップでは発生しません場合は、この代替法、、重く、ジスルフィド結合分泌ホスホリパーゼA 2 (SPLA 2)。この方法を利用して、我々は成功したカスパーゼ3切断と自己リン酸化7,8,9によってPAK2の活性化中に重水素化レベルの変化をモニターした。
ペプシン消化断片の同定は、H / D交換実験の重要なステップです。ペプチドの不正確な同定は、間違った結論を導くことができる。ペプシン消化PAK2は、きれいなバックグラウンドを得るために、逆相HPLC C18カラムに通して溶出させる。我々の実験では、40画分の合計を集め、MALDI – TOFに供した。複数のペプチドは、各画分で同定することができた。ペプチドはその配列を同定するためにタンデム質量分析計(Q – TOF MS / MSとoMALDI MS / MS)を行った。ペプチドのMS / MSスペクトルはペプチドの同定を確認するために少なくとも3つの製品のイオンを持つ必要があります。
データエクスプローラ4.0のコンピュータプログラム(アプライドバイオシステムズ)は、初期のベースライン補正やノイズフィルタを実行します。各スペクトルは2つのシークエンスピークに基づいて校正する必要があります。我々は、923.45と1697.84ですundeuteratedのm / zの理論的質量によって私達のスペクトルを校正。 T彼は、キャリブレーション後の質量精度は10ppmに達することができる。重水素化されると、モノ同位体は、より高い質量にシフトする場合があります。これらのm / zの比にユニタリステップの増加は、重水素化に関連付けられている強化された大衆が得られた。大量の封筒のピーク強度は、重水素化のレベルには影響しません。しかし、特定の質量の封筒の同位体ピークのピーク強度は、平均的な質量の計算のための非常に重要です。取り込まれた重陽子の計算の最初のステップは、重水素化サンプルから非重水素化試料のペプチド質量を引いている。他の3つの要因は、D 2 O希釈、側鎖に残留重陽子とバックの交換は、さらに計算( 図1)で考慮する必要があります。 D 2 Oの希釈は、H / D交換を開始するサンプルとD 2 Oのバッファを混合後、D 2 Oの希釈率です。ペプシン消化物の側鎖中の残留重陽子(4.5%)EDのペプチドは、減算する必要があります。バックの交換は、質量測定のプロセスのすべての重水素とペプシンで消化されたペプチドの重水素化の必然的な損失です。
H / D交換の24時間後にほとんどの溶媒にアクセス可能なペプチド(m / zの= 1105.60)は、完全な重水素化の領域を表します。ペプチドの各々に対して組み込ま重陽子の数は、重水素化や非重水素化PAK2消化ペプチドの重心の差です。最も高度に重水素化ペプチドのm / z 1105 PAK2は、H / D交換の24時間にいたときには完全な重水素化を表すために選ばれました。戻る交換比率は、ペプチドのm / z 1105のすべての可能な交換可能なサイトで割ったH / D交換の24時間で実際の組み込まれた重陽子の数によって算出した。
The authors have nothing to disclose.
この作品は、衛生費GM – 26738(JATまで)の国立研究所からの一部でサポートされています。
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
D2O | Aldrich | 7789-20-0 | |
α-cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma | 28166-41-8 | |
MALDI-TOF | PE Biosystems | Voyager DE STR | |
Q-TOF mass spectrometer | Q-TOF Ultima-Global | ||
QSTAR XL oMALDI MS/MS | Applied Biosystems | ||
Data Explorer 4.0 computer program | Applied Biosystems |