Intravital الميكروسكوب في الطحال : التحليل الكمي للتنقل الطفيلي وتدفق الدم
Summary
نعرض طريقة لأداء intravital المجهري للطفيليات GFP به الطحال الملاريا المعدلة وراثيا والكمي للتنقل الطفيلي وتدفق الدم داخل هذا الجهاز.
Abstract
وقد أتاح ظهور المجهري intravital في النماذج التجريبية الملاريا القوارض تقدما كبيرا في المعرفة 1،2 تفاعلات الطفيلي المضيف. وهكذا ، في مجال التصوير المجراة من طفيليات الملاريا خلال مراحل ما قبل الكريات الحمراء وكشفت مدخل نشطة من الطفيليات في الغدد الليمفاوية الجلد 3 ، والتنمية الكاملة للطفيل في الجلد 4 ، وتشكيل merosome الكبدية المستمدة من الهجرة ، وأؤكد الافراج عن merozoites في مجرى الدم 5. وعلاوة على ذلك ، فقد تم تطوير الطفيليات الفردية في كريات الدم الحمراء وثقت به مؤخرا 4D التصوير وتحدى وجهة نظرنا الحالية على التصدير البروتين في 6 الملاريا. وبالتالي ، قد تغيرت جذريا intravital التصوير رأينا في الأحداث الرئيسية في التنمية المتصورة. للأسف ، ودراسات للمرور الدينامية للطفيليات الملاريا من خلال الطحال ، وجهاز تكييف كبرى اللمفاوية المصابة بشكل رائع لمسح أحمر بخلايا lood تفتقر بسبب القيود التقنية.
باستخدام نموذج الفئران من الملاريا المنجلية yoelii في BALB / ج الفئران ، وقمنا بتنفيذ التصوير intravital في الطحال وذكرت إعادة تشكيل الفرق من ذلك وتمسك مطفول خلايا الدم الحمراء (pRBCs) لخلايا المنشأ حاجز ليفية في اللب الأحمر أثناء عدوى غير فتاكة الطفيلي 17X P.yoelii خط مقابل العدوى مع خط 17XL P.yoelii الطفيليات القاتلة 7. للوصول إلى هذه الاستنتاجات ، وضعت منهجية محددة باستخدام ImageJ البرمجيات الحرة لتمكين توصيف حركة ثلاثية الأبعاد من pRBCs سريع المفرد. النتائج التي تم الحصول عليها مع هذا البروتوكول يتيح تحديد السرعة ، واتجاهها والإقامة وقت الطفيليات في الطحال ، والتصدي لجميع المعلمات التقيد في الجسم الحي. بالإضافة إلى ذلك ، فإننا التقرير منهجية لتقدير حجم تدفق الدم باستخدام المجهر intravital واستخدام DIFferent التلوين وكلاء لاكتساب المعرفة في بنية معقدة من microcirculatory الطحال.
بيان الأخلاق
أجريت جميع الدراسات الحيوانية في مرافق الحيوانية من جامعة برشلونة ، وفقا للمبادئ التوجيهية والبروتوكولات التي وافقت عليها لجنة الأخلاقيات للتجارب على الحيوانات في جامعة برشلونة CEEA – UB (البروتوكول لا DMAH : 5429). وقد تم الحصول على الإناث BALB / ج الفئران من 6-8 أسابيع من العمر من مختبرات نهر تشارلز.
Protocol
Discussion
افتتح تنفيذ المجهري intravital في الطحال في هذه القوارض نموذجا الملاريا إمكانية التحقيق في مرور ديناميكية من الطفيليات من خلال هذا الجهاز الذي تم حتى الآن يعتبر "الصندوق الأسود" نظرا لاعتبارات تقنية. هنا ، وضعت جهدا كبيرا للتكيف مع أسلوب الكمية التي يسمح تحليل مقارن…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن ممتنون بشكل خاص لGraewe S. Heussler وخامسا لبرامج التدريب الأولي والمستمر في مدخلات intravital المجهري للطفيليات الملاريا ، إلى J. بيرنز للتبرع GFP الطفيليات المعدلة وراثيا ، وألف بوش (وحدة متحد البؤر ، CCIT – UB ، IDIBAPS) للحصول على المساعدة في تحليل الصور وتقدير وP. Astola للحصول على المساعدة التقنية. نشكر ر طوس أولا وCaralt لإنتاج الفيديو. MF هو حاصل على زمالة الدراسات العليا من عمومية من كاتالونيا. HAP هو أستاذ البحوث ICREA. ويتم تمويل عمل في مختبر HAP من برنامج الاتحاد الأوروبي الإطاري السابع (FP7/2007-2013) بموجب اتفاق منحة رقم 242095 ، من قبل مؤسسة خاصة سلكس (كاتالونيا ، اسبانيا) ، والاسبانية من قبل وزارة العلوم والابتكار ( SAF2009 – 07760).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Leica TCS-SP5 confocal microscope | Leica Microsystems, Heidelberg, Germany | TCS-SP5 Serial no. 5100000419 | |
| Ketamine (Ketolar 50 mg/ml) | Pfizer | 631028 | |
| Midazolam 15 mg/3 ml | Normon | 838193 | |
| 70,000 MW Dextran, conjugated to Texas Red | Molecular Probes | D1830 | |
| Fluorescein Isothiocyanate, isomer I (FITC) | Sigma | F7250 | |
| Hoechst 33342 | Sigma | H1399 | |
| Giemsa stain | Sigma | GS1 | Working solution is at 10% in distilled water |
| Super Glue-3 Loctite | Loctite | 9975-0880 |
References
- Amino, R., Menard, R., Frischknecht, F. In vivo imaging of malaria parasites–recent advances and future directions. Curr. Opin. Microbiol. 8, 407-414 (2005).
- Heussler, V., Doerig, C. In vivo imaging enters parasitology. Trends. Parasitol. 22, 192-195 (2006).
- Amino, R., Thiberge, S., Blazquez, S., Baldacci, P., Renaud, O., Shorte, S. Imaging malaria sporozoites. in the dermis of the mammalian. 2, 1705-1712 (2007).
- Gueirard, P., Tavares, J., Thiberge, S., Bernex, F., Ishino, T., Milon, G. Development of the malaria parasite in the skin of the mammalian host. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 18640-18645 (2010).
- Sturm, A., Amino, R., van de Sand, C., Regen, T., Retzlaff, S., Rennenberg, A. Manipulation of host hepatocytes by the malaria parasite for delivery into liver sinusoids. Science. 313, 1287-1290 (2006).
- Gruring, C., Heiber, A., Kruse, F., Ungefehr, J., Gilberger, T. W., Spielmann, T. Development and host cell modifications of Plasmodium falciparum blood stages in four dimensions. Nat. Commun. 2, 165-165 (2011).
- Martin-Jaular, L., Ferrer, M., Calvo, M., Rosanas-Urgell, A., Kalko, S., Graewe, S. Strain-specific spleen remodelling in Plasmodium yoelii infections in Balb/c mice facilitates adherence and spleen macrophage-clearance escape. Cell. Microbiol. 13, 109-122 (2011).
- Linden, M. v. a. n. d. e. r., R, . A Plasmodium berghei reference line that constitutively expresses GFP at a high level throughout the complete life cycle. Mol. Biochem. Parasitol. 137, 23-33 (2004).
- Cormack, B. P., Valdivia, R. H., Falkow, S. FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein. 173, 33-38 (1996).
- Dunn, K. W., Sandoval, R. M., Kelly, K. J., Dagher, P. C., Tanner, G. A., Atkinson, S. J. Functional studies of the kidney of living animals using multicolor two-photon microscopy. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 283, C905-C916 (2002).
- Zhong, Z., Petrig, B. L., Qi, X., Burns, S. A. In vivo measurement of erythrocyte velocity and retinal blood flow using adaptive optics scanning laser ophthalmoscopy. Opt. Express. 16, 12746-12756 (2008).
- Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node. Science. 296, 1869-1873 (2002).
- Bowdler, A. J. . The complete spleen. , (2002).
- Grayson, M. H., Hotchkiss, R. S., Karl, I. E., Holtzman, M. J., Chaplin, D. D. Intravital microscopy comparing T lymphocyte trafficking to the spleen and the mesenteric lymph node. Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 284, H2213-H2226 (2003).
- Khandoga, A. G., Khandoga, A., Reichel, C. A., Bihari, P., Rehberg, M., Krombach, F. In vivo imaging and quantitative analysis of leukocyte directional migration and polarization in inflamed tissue. PLoS. One. 4, 4693-4693 (2009).
- Weiss, L., Geduldig, U., Weidanz, W. Mechanisms of splenic control of murine malaria: reticular cell activation and the development of a blood-spleen barrier. Am. J. Anat. 176, 251-285 (1986).
- Swirski, F. K., Nahrendorf, M., Etzrodt, M., Wildgruber, M., Cortez-Retamozo, V., Panizzi, P. Identification of splenic reservoir monocytes and their deployment to inflammatory sites. Science. 325, 612-616 (2009).
- Grayson, M. H., Chaplin, D. D., Karl, I. E., Hotchkiss, R. S. Confocal fluorescent intravital microscopy of the murine spleen. J. Immunol. Methods. 256, 55-63 (2001).
- Bajenoff, M., Glaichenhaus, N., Germain, R. N. Fibroblastic reticular cells guide T lymphocyte entry into and migration within the splenic T cell zone. J. Immunol. 181, 3947-3954 (2008).
