Vi viser en metode til at udføre intravital mikroskopi af milten ved hjælp af GFP transgene malaria parasitter og kvantificering af parasitten mobilitet og blodgennemstrømningen inden for dette organ.
Fremkomsten af intravital mikroskopi i eksperimentelle gnaver malaria modeller har gjort store fremskridt med viden om parasit-vært interaktioner 1,2. Således har in vivo imaging af malaria parasitter under pre-erythrocytkoncentrationen stadier afslørede aktive indgangen af parasitter ind i huden lymfeknuder 3, den fuldstændige udvikling af parasitten i huden 4, og dannelsen af en hepatocyt-afledt merosome at sikre migration og frigivelse af merozoites i blodet 5. Desuden har udviklingen af de enkelte parasitter i erytrocytter for nylig blevet dokumenteret ved hjælp af 4D billedbehandling og udfordrede vores nuværende syn på protein eksport i malaria 6. Således har intravital imaging radikalt ændret vores holdning til vigtige begivenheder i Plasmodium udvikling. Desværre, undersøgelser af de dynamiske passage af malaria parasitter gennem milten, en stor lymfoide organ udsøgt tilpasset for at rydde inficeret rød blood celler er mangler på grund af tekniske begrænsninger.
Brug af murine model af malaria Plasmodium yoelii i BALB / c mus, har vi implementeret intravital billeder af milt og rapporterede en differentieret ombygning af det, og overholdelse af parasitized røde blodlegemer (pRBCs) til barriere celler fibroblastic oprindelse i den røde pulpa under infektion med den ikke-dødelige parasit line P.yoelii 17x i modsætning til infektioner med P.yoelii 17XL dødelige parasit linje 7. For at nå disse konklusioner, blev for en specifik metode bruger ImageJ gratis software udviklet til at muliggøre karakterisering af de faste tre-dimensionelle bevægelse af single-pRBCs. Opnåede resultater med denne protokol tillader bestemmelse af hastighed, retning og opholdstid af parasitter i milten, alle parametre fat overholdelse in vivo. Hertil kommer, rapport vi metoden for blodgennemstrømningen kvantificering ved hjælp af intravital mikroskopi og brugen af DIFskellige farvestoffer at få indsigt i den komplekse mikrocirkulatoriske strukturen af milten.
Etik erklæring
Alle dyr blev udført på dyret faciliteter University of Barcelona i overensstemmelse med retningslinjer og protokoller, der er godkendt af den etiske komité for dyreforsøg fra University of Barcelona CEEA-UB (protokol nr. DMAH: 5429). Kvinde BALB / c mus af 6-8 ugers alderen blev indhentet fra Charles River Laboratories.
Gennemførelsen af intravital mikroskopi af milten i denne gnaver malaria model åbnet mulighed for at undersøge den dynamiske passage af parasitter gennem dette organ, som indtil nu har været betragtet som en "black-box" på grund af tekniske overvejelser. Herinde blev en stor indsats sat til at tilpasse en kvantitativ metode, der giver mulighed for sammenlignende analyser af forskellige parasit linjer på enkelt og befolkning niveauer. I modsætning til andre væv og celler, der var blevet afbildet f…
The authors have nothing to disclose.
Vi er især taknemmelige for S. Graewe og V. Heussler for grunduddannelse og løbende input i intravital mikroskopi af malaria parasitter, til J. Burns for at donere GFP transgen parasitter, til A. Bosch (Konfokal Unit, det går stærkt ind-UB, IDIBAPS) for at få hjælp i billede analyse og kvantificering og P. Astola til teknisk bistand. Vi takker R. Tous og I. Caralt til videoproduktion. MF er en modtager af en kandidat stipendium fra den generelle betydning af Catalonien. HAP er en ICREA forskningsprofessor. Arbejde i laboratoriet af HAP er finansieret af Det Europæiske Fællesskabs syvende rammeprogram (FP7/2007-2013) under tilskudsaftale nr. 242095, af den selvejende institution Cellex (Catalonien, Spanien), og ved det spanske ministerium for videnskab og innovation ( SAF2009-07760).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Leica TCS-SP5 confocal microscope | Leica Microsystems, Heidelberg, Germany | TCS-SP5 Serial no. 5100000419 | |
Ketamine (Ketolar 50 mg/ml) | Pfizer | 631028 | |
Midazolam 15 mg/3 ml | Normon | 838193 | |
70,000 MW Dextran, conjugated to Texas Red | Molecular Probes | D1830 | |
Fluorescein Isothiocyanate, isomer I (FITC) | Sigma | F7250 | |
Hoechst 33342 | Sigma | H1399 | |
Giemsa stain | Sigma | GS1 | Working solution is at 10% in distilled water |
Super Glue-3 Loctite | Loctite | 9975-0880 |