Intravitale Microscopie van de milt: Kwantitatieve Analyse van Parasite Mobiliteit en Blood Flow
Summary
We tonen de methode voor het uitvoeren van intravitale microscopie van de milt met behulp van GFP transgene malariaparasieten en de kwantificering van de parasiet de mobiliteit en de bloedstroom binnen dit orgaan.
Abstract
De komst van intravitale microscopie in experimentele knaagdier malaria-modellen heeft het mogelijk grote stappen om de kennis van parasiet-gastheer interacties 1,2. Zo zijn in vivo beeldvorming van malariaparasieten tijdens de pre-erytrocytaire fase onthulde de actieve ingang van parasieten in de huid lymfeklieren 3, de volledige ontwikkeling van de parasiet in de huid 4, en de vorming van een hepatocyt-afgeleide merosome tot migratie te garanderen en vrijkomen van merozoïeten in de bloedstroom 5. Bovendien heeft de ontwikkeling van de individuele parasieten in erytrocyten is onlangs gedocumenteerd met behulp van 4D-imaging en daagde onze huidige visie op eiwit-export in malaria 6. Zo heeft intravitale imaging radicaal veranderd onze visie op belangrijke gebeurtenissen in Plasmodium ontwikkeling. Helaas, studies van de dynamische passage van malariaparasieten via de milt, een belangrijke lymfe-organen prachtig aangepast aan de geïnfecteerde rode b duidelijklood cellen ontbreekt wegens technische beperkingen.
Met behulp van de muizenmodel van malaria Plasmodium yoelii in Balb / c muizen, hebben we intravitale beeldvorming van de milt en rapporteerde een differentieel verbouwen ervan en de naleving van de parasitering rode bloedcellen (pRBCs) naar barrière-cellen van fibroblast oorsprong in de rode pulp tijdens het infectie met het niet-dodelijke parasiet lijn P.yoelii 17x in tegenstelling tot infecties met de P.yoelii 17XL dodelijke parasiet lijn 7. Het bereiken van deze conclusies, werd een specifieke methodologie met ImageJ gratis software ontwikkeld om de karakterisering van de snelle drie-dimensionale beweging van single-pRBCs mogelijk te maken. Resultaten verkregen met dit protocol laten het bepalen van de snelheid, richting en verblijftijd van parasieten in de milt, alle parameters het aanpakken van hechting in vivo. Daarnaast hebben we het verslag van de methodologie voor de bloedstroom kwantificeren met behulp van intravitale microscopie en het gebruik van DIFlende kleurstoffen om inzicht te krijgen in de complexe structuur microcirculatie van de milt.
Ethiek verklaring
Alle dieren werden uitgevoerd op het dier faciliteiten van de Universiteit van Barcelona in overeenstemming met richtlijnen en protocollen zijn goedgekeurd door de ethische commissie voor Dierproeven van de Universiteit van Barcelona CEEA-UB (Protocol nr. DMAH: 5429). Vrouwelijke Balb / c muizen van 6-8 weken oud werden verkregen van Charles River Laboratories.
Protocol
Discussion
De implementatie van intravitale microscopie van de milt in dit knaagdier malaria model opende de mogelijkheid van onderzoek naar de dynamische passage van parasieten door dit orgaan dat tot op heden beschouwd als een "black-box" te wijten aan technische overwegingen. Hier werd een grote inspanning te maken aan een kwantitatieve methode die vergelijkende analyse van verschillende parasieten lijnen op de single en de bevolking niveaus mogelijk aan te passen. In tegenstelling tot andere weefsels en cellen die ee…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We zijn bijzonder dankbaar dat S. en V. Graewe Heussler voor de initiële opleiding en permanente input in intravitale microscopie van malariaparasieten, aan J. Burns voor het doneren van GFP transgene parasieten, aan A. Bosch (Confocale Unit, CCIT-UB, IDIBAPS) voor hulp bij beeldanalyse en kwantificering en aan P. Astola voor technische ondersteuning. Wij danken R. Tous en I. Caralt voor video productie. MF is een ontvanger van een afgestudeerde beurs van de algemeenheid van Catalonië. HAP is een ICREA research professor. Werken in het laboratorium van de HAP wordt gefinancierd door het zevende van de Europese Gemeenschap Kaderprogramma (FP7/2007-2013) onder subsidieovereenkomst nr. 242095, door de Private Stichting CELLEX (Catalonië, Spanje), en door het Spaanse ministerie van Wetenschap en Innovatie ( SAF2009-07760).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Leica TCS-SP5 confocal microscope | Leica Microsystems, Heidelberg, Germany | TCS-SP5 Serial no. 5100000419 | |
| Ketamine (Ketolar 50 mg/ml) | Pfizer | 631028 | |
| Midazolam 15 mg/3 ml | Normon | 838193 | |
| 70,000 MW Dextran, conjugated to Texas Red | Molecular Probes | D1830 | |
| Fluorescein Isothiocyanate, isomer I (FITC) | Sigma | F7250 | |
| Hoechst 33342 | Sigma | H1399 | |
| Giemsa stain | Sigma | GS1 | Working solution is at 10% in distilled water |
| Super Glue-3 Loctite | Loctite | 9975-0880 |
References
- Amino, R., Menard, R., Frischknecht, F. In vivo imaging of malaria parasites–recent advances and future directions. Curr. Opin. Microbiol. 8, 407-414 (2005).
- Heussler, V., Doerig, C. In vivo imaging enters parasitology. Trends. Parasitol. 22, 192-195 (2006).
- Amino, R., Thiberge, S., Blazquez, S., Baldacci, P., Renaud, O., Shorte, S. Imaging malaria sporozoites. in the dermis of the mammalian. 2, 1705-1712 (2007).
- Gueirard, P., Tavares, J., Thiberge, S., Bernex, F., Ishino, T., Milon, G. Development of the malaria parasite in the skin of the mammalian host. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 18640-18645 (2010).
- Sturm, A., Amino, R., van de Sand, C., Regen, T., Retzlaff, S., Rennenberg, A. Manipulation of host hepatocytes by the malaria parasite for delivery into liver sinusoids. Science. 313, 1287-1290 (2006).
- Gruring, C., Heiber, A., Kruse, F., Ungefehr, J., Gilberger, T. W., Spielmann, T. Development and host cell modifications of Plasmodium falciparum blood stages in four dimensions. Nat. Commun. 2, 165-165 (2011).
- Martin-Jaular, L., Ferrer, M., Calvo, M., Rosanas-Urgell, A., Kalko, S., Graewe, S. Strain-specific spleen remodelling in Plasmodium yoelii infections in Balb/c mice facilitates adherence and spleen macrophage-clearance escape. Cell. Microbiol. 13, 109-122 (2011).
- Linden, M. v. a. n. d. e. r., R, . A Plasmodium berghei reference line that constitutively expresses GFP at a high level throughout the complete life cycle. Mol. Biochem. Parasitol. 137, 23-33 (2004).
- Cormack, B. P., Valdivia, R. H., Falkow, S. FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein. 173, 33-38 (1996).
- Dunn, K. W., Sandoval, R. M., Kelly, K. J., Dagher, P. C., Tanner, G. A., Atkinson, S. J. Functional studies of the kidney of living animals using multicolor two-photon microscopy. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 283, C905-C916 (2002).
- Zhong, Z., Petrig, B. L., Qi, X., Burns, S. A. In vivo measurement of erythrocyte velocity and retinal blood flow using adaptive optics scanning laser ophthalmoscopy. Opt. Express. 16, 12746-12756 (2008).
- Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node. Science. 296, 1869-1873 (2002).
- Bowdler, A. J. . The complete spleen. , (2002).
- Grayson, M. H., Hotchkiss, R. S., Karl, I. E., Holtzman, M. J., Chaplin, D. D. Intravital microscopy comparing T lymphocyte trafficking to the spleen and the mesenteric lymph node. Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 284, H2213-H2226 (2003).
- Khandoga, A. G., Khandoga, A., Reichel, C. A., Bihari, P., Rehberg, M., Krombach, F. In vivo imaging and quantitative analysis of leukocyte directional migration and polarization in inflamed tissue. PLoS. One. 4, 4693-4693 (2009).
- Weiss, L., Geduldig, U., Weidanz, W. Mechanisms of splenic control of murine malaria: reticular cell activation and the development of a blood-spleen barrier. Am. J. Anat. 176, 251-285 (1986).
- Swirski, F. K., Nahrendorf, M., Etzrodt, M., Wildgruber, M., Cortez-Retamozo, V., Panizzi, P. Identification of splenic reservoir monocytes and their deployment to inflammatory sites. Science. 325, 612-616 (2009).
- Grayson, M. H., Chaplin, D. D., Karl, I. E., Hotchkiss, R. S. Confocal fluorescent intravital microscopy of the murine spleen. J. Immunol. Methods. 256, 55-63 (2001).
- Bajenoff, M., Glaichenhaus, N., Germain, R. N. Fibroblastic reticular cells guide T lymphocyte entry into and migration within the splenic T cell zone. J. Immunol. 181, 3947-3954 (2008).
