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신경과학

Analisi della migrazione cresta neurale e la differenziazione delle specie da Cross-trapianto

Published: February 07, 2012
doi:
10.3791/3622
,
1Department of Biochemistry and Cell Biology,Rice University

Summary

Un approccio per l'analisi della migrazione e il destino finale di aviaria cellule della cresta neurale a quaglie-chick embrioni chimera è descritta. Questo metodo è una tecnica semplice e diretto per il tracciamento cellule della cresta neurale durante la migrazione e la differenziazione che sono altrimenti difficili da distinguere all'interno di un embrione di pollo non manipolata.

Abstract

Embrioni di uccelli fornire una piattaforma unica per studiare molti processi vertebrati sviluppo, a causa della facile accesso degli embrioni all'interno dell'uovo. Chimerici embrioni di uccelli, in cui è trapianto di tessuto donatore quaglie in un embrione di pollo in ovo, combinano la potenza di etichettatura indelebile genetica di popolazioni cellulari con la facilità di manipolazione presentata dalla embrione aviaria.

Quail-pulcino chimere sono uno strumento classico per il tracciamento migratori cellule della cresta neurale (CNC) 1-3. CNC sono una popolazione transitoria migratoria delle cellule nell'embrione, che sono originari della regione dorsale del 4 in via di sviluppo del tubo neurale. Sono sottoposte a uno di transizione epitelio mesenchimale e successivamente migrare verso altre regioni dell'embrione, dove si differenziano in vari tipi cellulari tra cui la cartilagine 5-13, 11,14-20 melanociti, neuroni e glia 21-32. I CNC sono multipotenti, e il loro destino finale è influenzato da 1) la regione del tubo neurale in cui hanno origine lungo l'asse rostro-caudale dell'embrione 11,33-37, 2) i segnali provenienti da cellule vicine mentre migrano 38-44, e 3) il microambiente della loro definitiva destinazione all'interno dell'embrione 45,46. Tracing queste cellule dal loro punto di origine al tubo neurale, alla loro posizione finale e il destino all'interno dell'embrione, fornisce informazioni importanti sui processi evolutivi che regolano patterning e l'organogenesi.

Il trapianto di regioni complementari del tubo neurale del donatore (omotopi innesto) o di diverse regioni del tubo neurale del donatore (trapianto eterotopico) può rivelare differenze di pre-specifiche della NCC lungo l'asse rostro-caudale 2,47. Questa tecnica può essere ulteriormente adattata per trapiantare un compartimento unilaterale del tubo neurale, in modo tale che un lato è derivato da tessuto donatore, e resti lato controlaterale imperturbato nell'embrione ospite, yiElding un controllo interno all'interno del campione stesso 2,47. Può anche essere adattato per il trapianto di segmenti del cervello in embrioni successive, dopo HH10, quando il tubo anteriore neurale è chiuso 47.

Qui riportiamo le tecniche per la generazione di quaglia-chick chimere Con il trapianto del tubo neurale, che consentono di rintracciare CNC migratori provenienti da un segmento discreta del tubo neurale. Specie-specifica etichettatura dei donatori cellule derivate con la quaglia anticorpo specifico QCPN 48-56 consente al ricercatore di distinguere donatore e cellule ospiti al punto finale sperimentale. Questa tecnica è molto semplice, poco costoso, e ha molte applicazioni, tra cui il destino-mapping, linea cellulare l'analisi e l'individuazione pre-patterning eventi lungo l'asse rostro-caudale 45. A causa della facilità di accesso al embrione aviaria, la quaglia-pulcino tecnica innesto può essere combinato con altre manipolazioni, inclusi ma non limitati a ablazione lente 40, l'iniezione di molecole inibitrici 57,58 o manipolazione genetica mediante elettroporazione di plasmidi di espressione 59-61, per identificare la risposta di particolari flussi migratori di CNC alle perturbazioni nel programma di sviluppo dell'embrione. Inoltre, questa tecnica innesto può anche essere usato per generare altri embrioni interspecifiche chimerici come quaglia anatra chimere per studiare contributo al NCC morfogenesi craniofacciale, o mouse-pulcino chimere di combinare la potenza di topo genetica con la facilità di manipolazione dell'embrione aviaria 62.

Protocol

1. Incubare pulcino e uova di quaglia allo stadio desiderato Per HH9 gli embrioni, i tempi di incubazione tipici variano da 29-33 ore a 38 ° C. 63 Lavare i detriti dalle uova con acqua tiepida. Disporre uova di gallina sul vassoio orizzontale. Contrassegnare il lato rivolto verso l'alto con matita, questo corrisponde alla regione in cui l'embrione viene localizzato. Incubare le uova di quaglia fine smussata up. Luogo in 38 ° C incubatore um…

Discussion

L'innesto di quaglia tubo neurale in embrioni di pollo di accoglienza qui descritto è una tecnica semplice e poco costoso per il tracciamento sottopopolazioni specifiche di migrazione NCC provenienti da diverse regioni lungo l'asse rostro-caudale 21,67-69. Questa tecnica sfrutta la facilità di accesso alle embrioni di uccelli (rispetto a embrioni mammiferi) e possono essere combinati con altre tecniche, come l'ablazione del tessuto, l'iniezione di molecole inibitrici, manipolazione genetica …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori ringraziano i membri del laboratorio Lwigale per la critica del manoscritto. SLG è supportato da una Ruth L. Kirschstein NRSA Fellowship dal National Eye Institute (F32 EY02167301). PYL è supportato dal National Eye Institute (EY018050).

Materials

Reagent Company Catalog number
Chick eggs Various – we use Texas A&M University’s Poultry Science Department, TX.  
Quail eggs Various – we use Ozarks Egg Company, MO.  
Egg incubator (Digital Readout 1502 Sportsman Incubator w/Humidity 110-120 Volt AC) www.poultrysupply.com 1502
Dumont AA forceps, Inox Epoxy-coated Fine Science Tools 11210-10
Scotch tape Any office supply store  
Curved Iris forceps Fine Science Tools 11065-07
India ink Any art supply store  
Pen/Strep (Penicillin, Streptomycin) Solution VWR International 101447-068
Clear Packing tape Any office supply store  
Needle pulling apparatus Narashige, Japan PE-21
Pulled glass needle, made from 1.5-1.8 x 100mm borosilicate glass capillary tube Kimble chase 34500 99
Pulled glass pipette, made from 5¾” Pasteur pipette Fisher Scientific 13-678-6A
Mouth pipette apparatus (aspirator tube assembly for calibrated microcapillary pipette) Sigma-Aldrich A5177-52A
Dumont #5 forceps Fine Science Tools 11251-30
Tungsten wire, 0.1mm diameter VWR International AA10404-H2
Needle holders (Nickel-plated pin holder) Fine Science Tools 26018-17
QCPN antiserum Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa QCPN
Alexa Fluor secondary antibody (e.g., Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG1) Invitrogen A21125
Ringer’s Solution (2L):
  • 14.4g NaCl
  • 0.34g CaCl2
  • 0.74g KCl
  • 0.230g Na2HPO4
  • 0.04g KH2PO4
  • ddH2O to 2L
  • Filter and autoclave
 All reagents from Fisher Scientific
  • 7647-14-5
  • 10043-52-4
  • 7447-40-7
  • 7558-79-4
  • 7778-77-0
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