Analyse de la migration des crêtes neurales et la différenciation par la Croix-espèces transplantation

Summary

Une approche pour l'analyse des migrations et le destin éventuel de cellules aviaires de la crête neurale chez la caille-poulet embryons chimériques est décrite. Cette méthode est une technique simple et directe pour le traçage des cellules de la crête neurale au cours de la migration et la différenciation qui seraient autrement difficiles à distinguer au sein d'un embryon de poulet non manipulée.

Abstract

Embryons aviaires fournir une plate-forme unique pour l'étude de nombreux vertébrés processus de développement, en raison de la facilité d'accès des embryons dans l'œuf. Chimériques embryons aviaires, dans lequel le tissu des bailleurs de fonds de caille est transplanté dans un embryon de poulet in ovo, combiner la puissance de l'étiquetage génétique indélébile de populations de cellules avec la facilité de manipulation présenté par l'embryon aviaire.

Quail-chiches chimères sont un outil classique pour tracer migratoires des cellules de la crête neurale (CCN) ^1-3. CCN sont une population de passage migratoire des cellules dans l'embryon, qui sont originaires de la région dorsale de la ⁴ du tube neural en développement. Ils subissent une transition épithélio-mésenchymateuse et migrent vers d'autres régions de l'embryon, où ils se différencient en différents types cellulaires, y compris le cartilage ^{5-13, 11,14-20} mélanocytes, les neurones et cellules gliales ^21-32. CCN sont multipotentes, et leur sort ultime est influencéeexpérimentés par 1) la région du tube neural dont ils sont issus le long de l'axe rostro-caudale de l'embryon ^11,33-37, 2) des signaux provenant des cellules voisines de leur migration ^38-44, et 3) le micro-ultime de leur destination à l'intérieur de l'embryon ^45,46. Suivre ces cellules à partir de leur point d'origine à du tube neural, à leur position finale et le sort au sein de l'embryon, donne un aperçu important dans les processus de développement qui régulent structuration et de l'organogenèse.

Transplantation des régions complémentaires du tube neural des bailleurs de fonds (homotopes greffage) ou différentes régions du tube neural des bailleurs de fonds (hétérotopique greffage) peut révéler des différences dans pré-spécification de CCN le long de l'axe rostro-caudal ^2,47. Cette technique peut être en outre adapté pour transplanter un compartiment unilatérale du tube neural, de telle sorte que d'un côté est dérivé du tissu du donneur, et les restes côté controlatéral imperturbable dans l'embryon d'accueil, yiElding un contrôle interne au sein du même échantillon ^2,47. Il peut également être adapté pour la transplantation de segments du cerveau chez les embryons plus tard, après HH10, lorsque le tube neural antérieur a fermé ^47.

Nous rapportons ici les techniques pour générer des cailles-chiches chimères par transplantation du tube neural, qui permettent de tracer des CNC migratoires provenant d'un segment distinct du tube neural. Spécifique à l'espèce marquage des cellules dérivées des bailleurs de fonds avec l'anticorps spécifique à la caille QCPN ^48-56 permet au chercheur de distinguer des donateurs et des cellules hôtes au point de fin d'expérimentation. Cette technique est simple, peu coûteux, et a de nombreuses applications, y compris le sort de cartographie, la lignée cellulaire de traçage et l'identification des pré-patterning événements le long de l'axe rostro-caudal ^45. En raison de la facilité d'accès à l'embryon aviaire, la technique de greffe caille-poussin peut être combiné avec d'autres manipulations, y compris mais non limité à ⁴ ablation lentille0, l'injection de molécules inhibitrices ^57,58, ou la manipulation génétique par électroporation de plasmides d'expression ^59-61, afin d'identifier la réponse de certains flux migratoires de CCN à des perturbations dans le programme de développement de l'embryon. En outre, cette technique de greffage peut aussi être utilisé pour générer d'autres embryons interspécifiques chimériques tels que la caille-canard chimères d'étudier la contribution de la CCN à la morphogenèse cranio-faciale, ou la souris-chiches chimères de combiner la puissance de la génétique de la souris avec la facilité de manipulation de l'embryon aviaire ^62.

Protocol

1. Incuber poussin et oeufs de caille à l'étape désirée Pour HH9 embryons, les durées d'incubation typiques vont de 29-33 heures à 38 ° C. 63 Laver les débris sur les oeufs avec l'eau tiède. Disposer des œufs de poule sur le plateau horizontalement. Marquer le côté orienté vers le haut avec le crayon; ce correspond à la région où l'embryon est localisé. Incuber oeufs de caille extrémité émoussée vers le haut. Lieu…

Discussion

Le greffage du tube neural de caille dans des embryons de poulet d'accueil décrit ici est une technique simple et peu coûteuse pour le traçage des sous-populations spécifiques de la migration CCN émanant de différentes régions le long de l'axe rostro-caudal ^21,67-69. Cette technique tire avantage de la facilité d'accès aux embryons d'oiseaux (par rapport aux embryons de mammifères) et peuvent être combinés avec d'autres techniques, telles que l'ablation des tissus, l'in…

Materials

Reagent	Company	Catalog number
Chick eggs	Various – we use Texas A&M University’s Poultry Science Department, TX.
Quail eggs	Various – we use Ozarks Egg Company, MO.
Egg incubator (Digital Readout 1502 Sportsman Incubator w/Humidity 110-120 Volt AC)	www.poultrysupply.com	1502
Dumont AA forceps, Inox Epoxy-coated	Fine Science Tools	11210-10
Scotch tape	Any office supply store
Curved Iris forceps	Fine Science Tools	11065-07
India ink	Any art supply store
Pen/Strep (Penicillin, Streptomycin) Solution	VWR International	101447-068
Clear Packing tape	Any office supply store
Needle pulling apparatus	Narashige, Japan	PE-21
Pulled glass needle, made from 1.5-1.8 x 100mm borosilicate glass capillary tube	Kimble chase	34500 99
Pulled glass pipette, made from 5¾” Pasteur pipette	Fisher Scientific	13-678-6A
Mouth pipette apparatus (aspirator tube assembly for calibrated microcapillary pipette)	Sigma-Aldrich	A5177-52A
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	11251-30
Tungsten wire, 0.1mm diameter	VWR International	AA10404-H2
Needle holders (Nickel-plated pin holder)	Fine Science Tools	26018-17
QCPN antiserum	Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa	QCPN
Alexa Fluor secondary antibody (e.g., Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG1)	Invitrogen	A21125
Ringer’s Solution (2L): 14.4g NaCl 0.34g CaCl2 0.74g KCl 0.230g Na2HPO4 0.04g KH2PO4 ddH2O to 2L Filter and autoclave	All reagents from Fisher Scientific	7647-14-5 10043-52-4 7447-40-7 7558-79-4 7778-77-0