줄기 세포 - 로드된 키토산 Microspheres의 배달을 위해 콜라겐 히드로겔을 구축
Summary
현재 줄기 세포 치료에서 주요 장애물은 호스트 조직으로 이들 세포를 전달하는 가장 효과적인 방법을 결정합니다. 지방 파생 줄기 세포들이 multipotency을 유지할 수 있도록하면서 여기에서, 우리는 효과적이고 접근 간단 키토산 기반의 전달 방법을 설명합니다.
Abstract
Multipotent 줄기 세포는 재생 의료 1-3 분야에서 매우 유용한 것으로 표시되었습니다. 그러나, 조직 재생을 위해 효과적으로 이들 세포를 사용하기 위해서는 변수의 수를 고려되어야한다. 이러한 변수는 다음과 같습니다 : 총 볼륨 및 주입 사이트의 표면적, 조직의 기계적 성질과 vascularization의 금액 및 세포외 기질의 구성 요소를 포함하는 조직 microenvironment를. 호스트 조직을 모방한 것이었 기계적 강도를 유지하면서 따라서 이러한 세포를 전달하기 위해 사용되는 자료는 정의된 화학 성분과 biocompatible이어야합니다. 이 자료는 또한 산소와 영양소를 세포 부착 및 분아 따위에 의해 번식하는 데 유리한 microenvironment를 제공하기 위해 대한 투과이어야합니다. 키토산, 우수한 biocompatibility과 양이온 다당류, 쉽게 화학적으로 바뀌었 및 생체내 맥에서 함께 바인딩 높은 친화력을 가지고 있습니다romolecules 4-5. 키토산은 세포 접착, 마이 그 레이션 및 확산을위한 기판으로 작동할 수 있도록, 세포외 기질의 glycosaminoglycan 부분을 모방한 것이었 지요. 본 연구에서는 입체 비계 6 기반의 콜라겐으로 지방 파생 줄기 세포 (ASC)를 제공하는 microspheres의 형태로 키토산을 활용. 이상적인 휴대 microsphere 비율은 배양 시간 및 로드할 수있는 세포의 최대 개수를 달성하기위한 세포 밀도에 대하여 산출된 것입니다. ASC는 키토산 microspheres (CSM)에 놓는되면, 그들은 콜라겐 발판에 포함된 및 확장 기간 동안 문화를 유지하실 수 있습니다. 요약이 연구는 정확하게 입체 biomaterial 발판 내에서 줄기 세포를 제공하는 방법을 제공합니다.
Protocol
1. 격리 지방 파생 줄기 세포 (ASC) 주의 : 별도로 명시하지 않는 한 모든 절차를 상온에서 수행되었다. 쥐 perirenal 및 epididymal 지방을 분리하고 이전 6 설명된대로 1퍼센트 태아 소 혈청 (FBS)을 포함하는 무균 행크의 버퍼 소금 용액 (HBSS)으로 씻는다. 조직을 말하다하고 실온에서 8 분 500g에서 50 ML 튜브 및 원심 분리기로 1퍼센트 FBS가 포함된 HB…
Discussion
줄기 세포 기반 요법의 주요 장애물은 수리를 위해 지정된 지역에 세포의 전달을위한 효율적인 방법을 개발하고있다. 환자의 다양성에 대한 환자로 인해 조직 유형, 부상 크기와 깊이, 전달하는 줄기 세포의 방법론은 사례별로 결정되어야합니다. 매트릭스 내에서 줄기 세포를 내장하고 상처 사이트에 배달하는 것은 조직 공학을위한 다음 논리적인 접근 방식 것으로 보이지만 몇 가지 기술적인 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
DOZ는 제네바 재단에서 수여 교부금에 의해 지원됩니다. SN은 피츠버그 조직 공학 이니셔티브에서 박사 과정 이수 화목 그랜트에 의해 지원되었다.
Materials
| Name of the reagent/equipment | Company | Catalogue number | Comments |
| Hanks BalancedSalt Solution (HBSS) | Gibco | 14175 | Consumable |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30071.03 | Consumable |
| Collagenase Type II | Sigma-Aldrich | C6685 | Consumable |
| 70-μm nylon mesh filter | BD Biosciences | 352350 | Consumable |
| 100-μm nylon mesh filter | BD Biosciences | 352360 | Consumable |
| MesenPRO Growth Medium System | Invitrogen | 12746-012 | Consumable |
| L-glutamine | Gibco | 25030 | Consumable |
| T75 Tissue Culture Flask | BD Biosciences | 137787 | Consumable |
| Chitosan | Sigma-Aldrich | 448869 | Consumable |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 320099 | Consumable |
| N-Octanol | Acros Organics | 150630025 | Consumable |
| Sorbitan-Mono-oleate | Sigma-Aldrich | S6760 | Consumable |
| Potassium Hydroxide | Sigma-Aldrich | P1767 | Consumable |
| Acetone | Fisher Scientific | L-4859 | Consumable |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 270741 | Consumable |
| Trinitro Benzenesulfonic Acid | Sigma-Aldrich | P2297 | Consumable |
| Hydrochloric Acid | Sigma-Aldrich | 320331 | Consumable |
| Ethyl Ether | Sigma-Aldrich | 472-484 | Consumable |
| 8-μm Tissue Culture Plate Inserts | BD Biosciences | 353097 | Consumable |
| 1.5-ml Microcentrifuge Tubes | Fisher | 05-408-129 | Consumable |
| MTT Reagent | Invitrogen | M6494 | Consumable |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8779 | Consumable |
| Qtracker Cell Labeling Kit (Q tracker 655) | Molecular probes | Q2502PMP | Consumable |
| Type 1 Collagen | Travigen | 3447-020-01 | Consumable |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | Consumable |
| 12-Well Tissue Culture Plates | BD Biosciences | 353043 | Consumable |
| Centrifuge | Eppendorf | 5417R | Equipment |
| Orbital Shaker | New Brunswick Scienctific | C24 | Equipment |
| Humidified Incubator with Air-5% CO2 | Thermo Scientific | Model 370 | Equipment |
| Overhead Stirrer | IKA | Visc6000 | Equipment |
| Magnetic Stirrer | Corning | PC-210 | Equipment |
| Vacuum Desiccator | – | – | Equipment |
| Particle Size Analyzer | Malvern | STP2000 Spraytec | Equipment |
| Water Bath | Fisher Scientific | Isotemp210 | Equipment |
| Spectrophotometer | Beckman | Beckman Coulter DU800UV/Visible Spectrophotometer | Equipment |
| Vortex | Diagger | 3030a | Equipment |
| Microplate Reader | Molecular Devices | SpectraMax M2 | Equipment |
| Light/Fluorescence Microscope | Olympus | IX71 | Equipment |
| Confocal Microscope | Olympus | FV-500 Laser Scanning Confocal Microscope | Equipment |
| Scanning Electron Microscope | Carl Zeiss MicroImaging | Leo 435 VP | Equipment |
| Transmission Electron Microscope | JEOL | JEOL 1230 | Equipment |
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Tags
Collagen HydrogelStem Cell-loaded Chitosan MicrospheresRegenerative MedicineImplantation SiteMechanical PropertiesVascularizationExtracellular MatrixBiocompatible MaterialsChemical CompositionMechanical StrengthPermeabilityOxygen And NutrientsChitosanCationic PolysaccharideChemical ModificationIn Vivo MacromoleculesGlycosaminoglycan PortionSubstrate For Cell AdhesionMigration And ProliferationAdipose-derived Stem Cells (ASC)Three-dimensional Scaffold
Cite This Article
Zamora, D. O., Natesan, S., Christy, R. J. Constructing a Collagen Hydrogel for the Delivery of Stem Cell-loaded Chitosan Microspheres. J. Vis. Exp. (64), e3624, doi:10.3791/3624 (2012).