Summary

Un pulido y reforzado Diluido cráneo-Ventana para a largo plazo de imágenes del cerebro de ratón

Published: March 07, 2012
doi:

Summary

Se presenta un método para formar una ventana de imagen en el cráneo del ratón que se extiende milímetros y es estable durante meses sin inflamación del cerebro. Este método es muy adecuado para estudios longitudinales de flujo de sangre, la dinámica celular, y células / estructura vascular utilizando microscopía de dos fotones.

Abstract

En vivo de imágenes de la función cortical requiere acceso óptico hasta el cerebro, sin alteración del medio ambiente intracraneal. Se presenta un método para formar un cráneo pulido y reforzado con adelgazado (puertos) ventana en el cráneo del ratón que se extiende por varios milímetros de diámetro y se mantiene estable desde hace meses. El cráneo está adelgazada para 10 a 15 micras de espesor con un taladro de mano para lograr la claridad óptica, y después se cubrió con pegamento de cianoacrilato y una cubierta de vidrio para: 1) proporcionar rigidez, 2) inhibir la regeneración ósea y 3) reducir la dispersión de luz a partir de las irregularidades sobre la superficie del hueso. Dado que el cráneo no se rompe, la inflamación que puede afectar al proceso objeto de estudio se reduce considerablemente. Profundidades de imagen de hasta 250 micras por debajo de la superficie cortical se puede lograr utilizando dos fotones de microscopía de barrido láser. Esta ventana se adapta bien para estudiar el flujo sanguíneo cerebral y la función celular en forma de preparados tanto anestesiados y despierto. Además, ofrece la optunidad para manipular la actividad de células utilizando optogenética o para interrumpir el flujo de sangre en los vasos dirigidos por irradiación de circulante fotosensibilizadores.

Protocol

1. Preparativos para la operación i Limpiar los instrumentos quirúrgicos por tratamiento con ultrasonidos en una mezcla de leche Maxizyme y Quirúrgicas en un limpiador ultrasónico. Autoclave de los instrumentos quirúrgicos antes de cada experimento. Asegúrese de que todos los reactivos necesarios y desechables están disponibles. Una lista de los reactivos y desechables se proporciona en la Tabla 2. Los reactivos y material desechable que entran en contacto con los tejidos expuestos…

Discussion

De dos fotones de imágenes a través de una ventana de los puertos exige la transmisión a través del hueso adelgazado y la duramadre, que atenúa la luz del láser, y añade las aberraciones ópticas a mayores profundidades 8. Sin embargo, a pesar de este inconveniente, las profundidades de imagen de hasta 250 micras por debajo de la superficie pial se puede lograr con 900 nm de excitación. Mayores profundidades de imagen puede ser en principio posible con longitudes de onda de excitación más largos <su…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por la American Heart Association (beca posdoctoral de AYS) y los Institutos Nacionales de Salud (MH085499, EB003832 y OD006831 a DK). Damos las gracias a Bet Friedman y Blinder Pablo de comentarios sobre el manuscrito.

Materials

Agent Route of delivery Dose for mouse Duration Notes Source Ref Ref
Pentobarbital (Nembutal) IP 90 μg/g 15-60 min Narrow safety margin. Work up to proper dose of anesthesia slowly. Supplement 10 % of induction dose as required. 036093; Butler Schein 7
Ketamine (Ketaset) mixed with Xylazine (Anased) IP 60 μg/g (K)
10 μg/g (X) (mix in same syringe)
20-30 min Xylazine is co-injected as a muscle relaxant and analgesic. Supplement only Ketamine at 50% of induction dose as required. (K) 010177, (X) 033198; Butler Schein 7
Isoflurane (Isothesia) Inhalation 4% mean alveolar concentration (MAC) for induction; 1-2% MAC for maintenance 4-6 h. Provided in mixture of 70% oxygen and 30% nitrous oxide. Prolonged anesthesia leads to slow recovery. 029403; Butler Schein 26

Table 1. Suggested anesthetic agents for survival studies.

ITEM COMPANY CATALOG # / MODEL
Betadine Butler Schein 6906950
Buprenorphine (Buprenex) Butler Schein 031919
Fluorescein isothiocyanate dextran, 2 MDa molecular weight Sigma FD2000S
Isopropyl alcohol Fisher AC42383-0010
Lactated Ringer’s Solution Butler Schein 009846;
Lidocaine solution, 2 % (v/v) Butler Schein 002468
Saline Butler Schein 009861
Surgical Milk Butler Schein 014325
Texas Red dextran, 70 kDa molecular weight Invitrogen D1864
Maxizyme Butler Schein 035646
DISPOSABLES
Carbide burrs, 1/2 mm tip size Fine Science Tools 19007-05
Cottoned tip applicators Fisher Scientific 23-400-100
Cover Glass, no. 0 thickness Thomas Scientific 6661B40
Cyanoacrylate glue ND Industries 31428 H04308
Gas duster Newegg N82E16848043429
Grip cement powder Dentsply 675571
Grip cement solvent Dentsply 675572
Insulin syringe, 0.3 mL volume with 29.5 gauge needle Butler Schein 018384
Nut and bolt to secure the head Digikey Nut, H723-ND; bolt, R2-56X1/4-ND
Opthalmic ointment Butler Schein 039886
Scalpel blades Fisher Scientific 12-460-448
Screws, self-tapping #000 J.I. Morris Company FF000CE125
Silicone aquarium sealant Perfecto Manufacturing 31001
Tin oxide powder Mama’s Minerals EQT-TINOX
EQUIPMENT
Glass scribe Fisher Scientific 08-675
Dissecting microscope Carl Zeiss OPMI-1 FC
Electric powered drill Foredom or Osada K.1020 (Foredom) or EXL-M40 (Osada)
Electrical razor Wahl Series 8900
Forceps, Dumont no. 55 Fine Science Tools 11255-20
Feedback regulated heat pad FHC 40-90-8 (rectal thermistor, 40-90-5D-02; heat pad, 40-90-2-07)
Isoflurane vaporizer Ohmeda IsoTec4
Pulse oximeter Starr Life Sciences MouseOx
Screwdriver, miniature Garret Wade 26B09.01
Stereotaxic frame Kopf Instruments Model 900 (with mouse anesthesia mask and non-rupture ear bars)
Surgical scissors, blunt end Fine Science Tools 14078-10
Ultrasonic cleaner Fisher Scientific 15-335-30

Table 2. List of specific reagents, disposables and equipment.

References

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Shih, A. Y., Mateo, C., Drew, P. J., Tsai, P. S., Kleinfeld, D. A Polished and Reinforced Thinned-skull Window for Long-term Imaging of the Mouse Brain. J. Vis. Exp. (61), e3742, doi:10.3791/3742 (2012).

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