הכרומטין immunoprecipitation (שבב) באמצעות תסיסנית רקמה
Summary
לאחרונה תפוקה גבוהה טכנולוגיית ריצוף גדלה מאוד הרגישות של הכרומטין immunoprecipitation (שבב) הניסוי מתבקש יישומו באמצעות תאים או רקמות גזור מטוהרים. כאן אנו קובעים שיטה להשתמש בטכניקה שבב עם<em> תסיסנית</emרקמת>, אשר יכול להתמודד עם מצב הכרומטין אנדוגני במערכת הביולוגית היטב מאופיין.
Abstract
אפיגנטיקה נשאר בתחום המתפתח במהירות כי מחקרים איך המדינה הכרומטין תורם ביטוי ההפרש גנים סוגי תאים שונים בשלבים התפתחותיים שונים. תקנה epigenetic תורם ספקטרום רחב של תהליכים ביולוגיים, כולל התמיינות במהלך ההתפתחות העוברית הומאוסטזיס בבגרות. אסטרטגיה קריטית במחקרים אפיגנטים המשנים היא לבחון כיצד שינויים היסטון שונים וגורמים הכרומטין לווסת את ביטוי הגנים. לכתובת זו, הכרומטין immunoprecipitation (שבב) נעשה שימוש נרחב כדי לקבל תמונת מצב של הקשר של גורמים מסוימים עם ה-DNA בתאים של עניין.
הטכניקה שבב כלל משתמשת בתאי תרבית חומר המוצא, אשר ניתן להשיג בשפע והומוגניות להפיק נתונים לשחזור. עם זאת, ישנם מספר תנאים: ראשית, הסביבה לגדול תאים בצלחת פטרי שונה מזה in vivo, ולכן עשוייםלא משקפים את מצב הכרומטין אנדוגני של התאים בכל יצור חי. שנית, לא כל סוגי התאים יכולים להיות vivo לשעבר תרבותי. יש רק מספר מוגבל של שורות תאים, אשר אדם יכול להשיג מספיק חומר assay שבב.
כאן אנו מתארים שיטה לעשות ניסוי שבב באמצעות רקמות תסיסנית. חומר המוצא היא גזור רקמה מן החי, ובכך יכול לשקף במדויק את מצב הכרומטין אנדוגני. ההסתגלות של שיטה זו עם סוגים שונים של רקמות יאפשר לחוקרים להתייחס הרבה יותר מבחינה ביולוגית שאלות רלוונטיות לגבי רגולציה epigenetic ב 1 vivo, 2. שילוב שיטה זו עם רצף תפוקה גבוהה (שבב ואילך) יהיה עוד יותר לאפשר לחוקרים לקבל הנוף epigenomic.
Protocol
Discussion
צדדיות של ניתוחים שבב שנדונו פרוטוקול זה יכול לשמש על רקמות שונות, אשר מספק הזדמנות לבחון את מצב הכרומטין במערכת רלוונטיות מבחינה ביולוגית. ניסויים שבב באמצעות תאים בתרבית ממערכות נוח לבצע בגלל כמות גדולה של תאים ניתן להשיג בקלות. עם זאת, תאים בתרבית אינן משקפות בהכר…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות מעבדה ד"ר Keji של ג'או (NIH / NHLBI) על עזרתם במתן תוצאות רצף. אנו רוצים גם להודות פרויקט הגנום UCSC לשימוש של דפדפן הגנום לדמיין רצף ממופה קורא.
עבודה זו נתמכה על ידי מסלול R00HD055052 NIH להעניק העצמאות R01HD065816 מ NICHD, Parkard לוסיל קרן, ואת ג 'ון הופקינס סטארט אפ מימון XC
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Complete Mini protease inhibitor cocktail | Roche | 11836153001 | |
| Formaldehyde (37%) | Supelco | 47083-U | |
| PMSF | Sigma | 78830 | |
| Kontes pellet pestle | Fischer Scientific | K749521-1590 | |
| PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| Linear polyacrylamide | Sigma | 56575-1ML | |
| Glycogen | Qiagen | 158930 | |
| SYBR green/ROX qPCR Master Mix | Fermentas | K0223 | |
| Mini plate spinner | Labnet | Z723533 | |
| Real time PCR system | Applied Biosystem | 4351101 | |
| Small Volume Ultrasonic Processor | Misonix | HS-XL2000 | Model discontinued |
| Dynabeads, Protein A | Invitrogen | 100-01D | |
| Dynamag magnet | Invitrogen | 123-21D | |
| Phenol:Chlorofrom:IAA | Invitrogen | 15593-049 | |
| Epicentre DNA END-Repair Kit | Epicentre Biotechnologies | ER0720 | |
| MinElute Reaction Cleanup Kit | Qiagen | 28204 | |
| Klenow Fragment (3’→5′ exo–) | New England Biolabs | M0212S | |
| T4 DNA ligase | Promega Corporation | M1794 | |
| Adaptor oligonucleotides | Illumina | PE-400-1001 | |
| Paired-End Primer 1.0 and 2.0 | Illumina | 1001783 1001 784 |
|
| E-Gel Electorphoresis system | Invitrogen | G6512ST | |
| 2X Phusion HF Mastermix | Finnzymes | F-531 |
References
- Kharchenko, P. V., Alekseyenko, A. A., Schwartz, Y. B., Minoda, A., Riddle, N. C., Ernst, J., Sabo, P. J., Larschan, E., Gorchakov, A. A., Gu, T. Comprehensive analysis of the chromatin landscape in Drosophila melanogaster. Nature. 471, 480-485 (2011).
- Filion, G. J., van Bemmel, J. G., Braunschweig, U., Talhout, W., Kind, J., Ward, L. D., Brugman, W., de Castro, I. J., Kerkhoven, R. M., Bussemaker, H. J., van Steensel, B. Systematic protein location mapping reveals five principal chromatin types in Drosophila cells. Cell. 143, 212-224 (2010).
- Barski, A., Cuddapah, S., Cui, K., Roh, T. Y., Schones, D. E., Wang, Z., Wei, G., Chepelev, I., Zhao, K. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129, 823-837 (2007).
- Chen, X., Lu, C., Prado, J. R., Eun, S. H., Fuller, M. T. Sequential changes at differentiation gene promoters as they become active in a stem cell lineage. Development. 138, 2441-2450 (2011).
- Gonczy, P., Matunis, E., DiNardo, S. bag-of-marbles and benign gonial cell neoplasm act in the germline to restrict proliferation during Drosophila spermatogenesis. Development. 124, 4361-4371 (1997).
- McKearin, D. M., Spradling, A. C. bag-of-marbles: a Drosophila gene required to initiate both male and female gametogenesis. Genes Dev. 4, 2242-2251 (1990).
- Gan, Q., Schones, D. E., Eun, S. H., Wei, G., Cui, K., Zhao, K., Chen, X. Monovalent and unpoised status of most genes in undifferentiated cell-enriched Drosophila testis. Genome Biol. 11, 42-42 (2010).
- Gan, Q., Chepelev, I., Wei, G., Tarayrah, L., Cui, K., Zhao, K., Chen, X. Dynamic regulation of alternative splicing and chromatin structure in Drosophila gonads revealed by RNA-seq. Cell Res. 7, 763-783 (2010).
