최근 높은 처리량 시퀀싱 기술은 크게 염색질 Immunoprecipitation (칩) 실험의 감도를 증가하고 정화 셀 또는 해부 조직을 사용하여 응용 프로그램을하라는 메시지가있다. 여기에 칩 기술을 사용하는 방법을 윤곽을 그리다 Drosophila 조직.
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이 논문에서
요약
초록
Epigenetics는 급속히 발전 분야 남아 그 염색질 상태가 서로 다른 개발 단계에서의 서로 다른 세포 유형에서 차동 유전자 발현에 기여하는 방법 연구. Epigenetic 규제는 성인의 배아 발달과 항상성 동안 세포 분화를 포함하여 생물 학적 과정의 광범위한 스펙트럼에 기여한다. epigenetic 연구에 중요한 전략은 다양한 히스톤 수정 및 염색질 요인이 유전자 발현을 조절하는 방법 검토하는 것입니다. 이것을 해결하기 위해, 염색질 Immunoprecipitation (CHIP)이 관심의 세포에있는 DNA와 특정 요인 협회의 스냅샷을 얻기 위해 널리 사용됩니다.
칩 기술은 일반적으로 재현할 데이터를 생성하기 위해 풍부하고 균질성에서 얻을 수 재료를 시작으로 교양 세포를 사용합니다. 그러나 몇 가지주의 사항이 있습니다 : 첫째, 배양 접시에있는 세포를 성장 환경은 따라서 생체내의 그것과는 차이가 있습니다살아있는 유기체의 세포 내생 염색질 상태를 반영하지. 둘째, 세포의 모든 유형은 교양 전직 생체내 될 수 있습니다. 사람들이 칩 분석을위한 충분한 자료를 얻을 수있는 세포 라인의 단지 제한된 수의이 있습니다.
여기 Drosophila 조직을 사용하여 칩 실험을 할 방법을 설명합니다. 시작 자료는 따라서 정확하게 내생 염색질 상태를 반영할 수, 살아있는 동물에서 조직을 해부하고 있습니다. 조직의 다양한 종류가있는이 방법의 적응성은 연구자 더 생물학적으로 많은 생체내 1, 2의 epigenetic 규제에 관한 관련 질문을 해결하실 수 있습니다. 높은 처리량 시퀀싱 (칩 seq)와 함께이 방법을 결합하면 더욱 연구자 epigenomic 풍경을 얻을 수 있습니다.
프로토콜
(전체 칩 절차는 오버 일 정도 소요됩니다. 높은 처리량 시퀀싱을위한 칩 라이브러리의 작성은 다른 2~3일 소요됩니다.)
1. 해부 및 칩 실험 (~ 1,000,000 세포)에 대한 조직의 준비
- 차가운 PBS + 1X 프로 테아제 억제제 (7x 주식 솔루션을 얻기 위해 1.5 ML 1X PBS에서 테아제 억제제 칵테일 중 1 개의 펠릿를 해산)에서 (Drosophila testes의 예 2백쌍)에 관심있는 조직을 해부 + PMSF (최종 농도 100 μg / ml) 쇼핑. 두 조직을 씻어하고 억제제와 같은 PBS 용액 200 μL에 조직을 resuspend.
- 예제를 해결하려면, 5.5 μL 37%의 포름 알데히드를 (37 사용하기 전에 1 분 용 ° C의 물을 욕조에 따뜻한 포름 알데히드) 추가합니다. 15 분 와동 사이에 매 5 분 동안 37 ° C에서 품어.
- 2 분 동안 진정시킬 수 있도록 조직을 위해 얼음에 샘플을 놓습니다. 450 μL PBS (프로 테아제 억제제와 PMSF와)과 2X 린스. 샘플은 이제 매장이 될 수-20 ° C.에서 D 감자칩 충분한 자료를 얻기 위해 절개를 여러 번 반복합니다.
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토론
이 프로토콜에서 언급한 칩 분석의 다양성은 생물학적으로 관련 시스템에 염색질 상태를 공부할 수있는 기회를 제공하는 다른 조직에 사용할 수 있습니다. 교양 시스템에서 세포를 이용한 칩 실험은 세포의 대량 쉽게 얻을 수 있기 때문에 수행할 편리합니다. 그러나 교양 전지는 반드시 멀티 셀룰러 환경에서 세포를 반영하지 않습니다. 살아있는 동물의 해부 조직을 이용해이 기술을 개발함으로써 우리는 많은 질문을 해결할 수있는 교양 세포가 안돼요.
이 프로토콜의 유용에도 불구하고, 몇 가지주의 사항이 있습니다. 예를 들어, 해부하는 조직은 여전히 여러 가지 세포 유형과 이기종입니다. 비교적 균일한 세포와 같은 imaginal 디스크, 내장과 같은 다른 조직, testes, 모든 제한된 성인 줄기 세포를 포함하는 이기종 있습니다 난소와 같은 Drosophila 조직에서 얻을 수 있지만. 이러한 합병증은 부분적으로 수강력한 Drosophila 유전자를 사용하여.......
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공개 사항
우리는 공개 할게 없다.
감사의 글
저자 시퀀스 결과를 제공하는 그들의 도움 박사 Keji 조의 연구소 (NIH / NHLBI)에 감사드립니다. 우리는 또한 매핑 시퀀싱 읽은을 시각화하기위한 게놈 브라우저의 사용을 위해 UCSC 게놈 프로젝트를 감사드립니다.
이 작품은 신생 XC로 자금 NICHD, Lucile Parkard 재단, 그리고 존스 홉킨스 대학에서 독립 수상 및 R01HD065816에 R00HD055052 NIH 경로에 의해 지원되었습니다
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약의 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
| 전체 미니 테아제 억제제 칵테일 | 로슈 | 11836153001 | |
| 포름 알데히드 (37 %) | Supelco | 47083-U | |
| PMSF | 시그마 | 78,830 | |
| Kontes 펠릿 유봉 | 피셔 과학 | K749521-1590 | |
| PCR 정화 키트 | Qiagen | 28,104 | |
| 선형 polyacrylamide | 시그마 | 56575-1ML | |
| 글리코겐 | Qiagen | 158,930 | |
| SYBR 녹색 / ROX qPCR 마스터 믹스 | Fermentas | K0223 | |
| 미니 플레이트 스피너 | Labnet | Z723533 | |
| 실시간 PCR 시스템 | 응용 Biosystem | 4,351,101 | |
| 작은 볼륨 초음파 프로세서 | Misonix | HS-XL2000 | 모델 중단 |
| Dynabeads, 단백질 | Invitrogen | 100-01D | |
| 자석을 Dynamag | Invitrogen | 123-21D | |
| 페놀 : Chlorofrom : IAA | Invitrogen | 15593-049 | |
| Epicentre DNA를 최종 수리 키트 | Epicentre의 Biotechnologies | ER0720 | |
| MinElute ReactioN 정리 키트 | Qiagen | 28,204 | |
| Klenow 조각 (3 '→ 5'엑소-) | 뉴잉글랜드 Biolabs | M0212S | |
| T4의 DNA ligase | Promega Corporation은 | M1794 | |
| 어댑터 oligonucleotides | Illumina | PE-400-1001 | |
| 이점 엔드 프라이머 1.0 및 2.0 | Illumina | 1,001,783 1001 784 | |
| E-젤 Electorphoresis 시스템 | Invitrogen | G6512ST | |
| 2X Phusion HF Mastermix | Finnzymes | F-531 |
참고문헌
- Kharchenko, P. V., Alekseyenko, A. A., Schwartz, Y. B., Minoda, A., Riddle, N. C., Ernst, J., Sabo, P. J., Larschan, E., Gorchakov, A. A., Gu, T. Comprehensive analysis of the chromatin landscape in Drosophila melanogaster. Nature. 471, 480-485 (2011).
- Filion, G. J., van Bemmel, J. G., Braunschweig, U., Talhout, W., Kind, J., Ward, L. D., Brugman, W., de Castro, I. J., Kerkhoven, R. M., Bussemaker, H. J., van Steensel, B.
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재인쇄 및 허가
