세포 prion 단백질의 새로운 종 (PRP C) 최근 여기에 설명 된 방법을 사용하여 감염되지 않은 인간의 뇌에서 발견되었습니다. 그들 중 일부는 인간의 두뇌에서 다른 misfolded 단백질 응집체를 분리에 유용합니다 동안 이러한 방법은 다양한 PRP 종을 분리하는 데 사용할 수 있습니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
prion 질환의 pathogenesis에 중심 이벤트가 병원성 이소 형 PRP SC 하나에 호스트 인코딩 세포 prion 단백질 PRP C의 전환을 포함한다. PRP SC는 세제 - 불용성 응집체를 형성하고 PK 2-6로 부분적으로 강한 반면 PRP C는 세제 - 용해와 proteinase K (PK) - 소화에 민감합니다. PRP SC에 PRP C의 변환은 단백질의 β-시트 구조로 α-나선형의 conformational 변화를 포함하는 것으로 알려져 있습니다. 그러나, 생체 경로에있는이 아직 제대로 이해된다. 임시 내생 PRP SC, 중급 PRP * 또는 "자동 prion"는 감염되지 않은 뇌 7에서 확인되지 않았습니다.
biophysical 및 생화학 방법의 조합을 사용하여, 우리는 감염되지 않은 포유류의 두뇌와 neuronal 양식에서 불용성 PRP C 집계를 (지정 iPrP C) 확인세포 8, 9. 여기, 우리는 세제 버퍼, 자당 단계 기울기 침강, 크기 제외 크로마토 그래피, 특히 구조적으로 변경 PRP 양식 10, PK-치료에 바인딩 유전자 5 단백질 (g5p)로 iPrP 농축에 ultracentrifugation을 포함한 이러한 방법에 대한 자세한 절차를 설명합니다. 이러한 접근 방식의 조합은 불용성 PRP SC와 PRP C 합산뿐만 아니라 정상적인 인간의 뇌에서 용해 PRP C의 oligomers뿐만 아니라를 분리합니다. 프로토콜은 감염된 두뇌와 감염되지 않은 뇌의 iPrP C에서 PRP SC를 모두 분리하는 데 사용되었습니다 여기에 설명 된 이후, 사람들은 물리 기능, neurotoxicity, 두 isoforms 사이의 감염의 차이를 비교 할 수있는 기회를 제공. 이러한 연구는 크게 전염성 proteinaceous 병원균의 우리의 이해를 향상됩니다. iPrP C의 생리학과 pathophysiology는 현재 불분명합니다. 특히, 새로 이드entified 인간 prion 질환은 단백 분해 효소에 민감한 prionopathy variably이라고한다, 우리는 iPrP C 11, 12과 immunoreactive 행동과 분열을 공유하는 PRP SC를 발견했다. 또한, 우리는 최근 iPrP C는 알츠하이머 병 13 아밀로이드-β 단백질과 상호 작용의 주요 수종입니다 보여 주었다. 같은 연구에서,이 방법은 다른 neurodegenerative 장애에 관여하지 않는 prion 단백질 응집체에 자신의 응용 프로그램을 제안, 알츠하이머 병 13 Abeta 집계 및 oligomers를 분리하는 데 사용되었습니다.
프로토콜
1. 뇌 Homogenate 및 세제 용해 (S2)과 불용성 (P2) 분수의 작성
- 100 MG 냉동 인간의 뇌 조직을 타고 (10 MM 트리스, 150 MM NaCl, 0.5 % Nonidet P-40 (NP-40), 0.5 % EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 산도 7.4) 100 μl 용해 버퍼를 추가합니다.
- 무선 모터에 의해 구동 유봉을 사용하여 얼음에 균질화,이 중 20 5 분에 드라이 아이스에 고정하고 모터에 의해 먼저하고 손에 의해 구동 유봉을 사용하여 다시 균질화, 300 μl 또는 800 μl 용해 버퍼를 (추가 % 또는 10 % 총 뇌 homogenate, 각각).
- 4에 10 분 ° C가 benchtop 원심 분리기를 사용하여 표면에 뜨는 (S1)를 수집하는 1,000 XG에서 20 % 또는 10 % 총 뇌 homogenate를 원심 분리기.
- 4 ° C.에 1 시간에 SW55 로터의 35,000 RPM (100,000 XG) (Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀 베는 날, 풀러 턴, CA)에서 10 % S1을 Ultracentrifuge 깨끗한 튜브에 세제 - 수용성 일부를 포함 supernatants을 (S2) 전송합니다. 세제 - 불용성 포함 된 알약을 Resuspend5 배 농축 준....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
여기에보고 된 접근 방식의 조합은 정상적인 인간의 뇌에서 지속적으로 불용성 PRP C 집계 및 가용성 PRP C의 oligomers를 분리합니다. 1 시간 100,000 XG의 Ultracentrifugation는 널리 가용성 PRP C 14 일부터 불용성 PRP SC의 분리에 사용 된 고전적인 방법입니다. 가,주의 중 하나를 효율적이지만 원심 분리 한 후 (S2) 표면에 뜨는 당기는 동안 오염을 방지하는 것입니다. iPrP C의 젤 프로필 PRP C의 구별이기 때문에 P2 분수에서 검색된 PRP는 S2의 오염으로 인한 않을 수도 있습니다. 자당 기울기 침강 분석들은 밀도, 크기 및 모양 15 일 기준으로 다양한 PRP SC 종을 분리하는 데 사용되었습니다. 우리는 분수 (12)는 이러한 비율은 설명 할 수없는 할 수 있습니다 몇 가지 입자가 포함 된 것으로 나타났습니다........
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
감사의 글
저자는 정상적인 뇌 샘플을 제공하는 인간의 뇌와 척수 리소스 센터 (로스 앤젤레스, CA)에 감사하고 있습니다. 이 연구는 McGregor 재단의 지원과 대통령의 잉여 자금 기금 (케이스 웨스턴 리저브 대학)과 국립 보건원 (NIH) R01NS062787, CJD 재단, 연합 BioSecure뿐만 아니라 대학 노화에 센터와 건강에 의해 지원되었다 .
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약의 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 코멘트 (선택 사항) |
| Phenylmethylsulfonyl 불소 | 시그마 - 알드리치 | P7626 | 2 - 프로 파놀에서 72 MM |
| Proteinase K | 시그마 - 알드리치 | P2308 | H 2 O 2 MG / ML |
| PNGase F | 뉴 잉글랜드 Biolabs | MWGF200 | |
| LE-80K, SW55 로터를 Ultracentrifuge | Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀 베는 날 | 부품 번호 365668, 356860 | |
| Superdex 200 HR 비즈 | GE 헬스 케어 | 17-1088-01 | |
| 악타 FPLC 시스템 | GE 헬스 케어 | 18-1900-26 | |
| 분자량 마커 | 시그마 - 알드리치 | MWGF200 | 다양 |
| Dynabeads M-280 자성 비즈 | Invitrogen | 143-01 | |
| 3F4 항체 | Covance | SIG-39600 | |
| 1E4 항체 | 세포 과학 | M1840 | |
| 준비 젤 15% 트리스 - HCL 사전 주조 젤 | 바이오 RAD | 345-0020 |
참고문헌
- Prusiner, S. B. Prions. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 13363-13383 (1998).
- Oesch, B., Westaway, D., Wälchli, M., McKinley, M. P., Kent, S. B. H., Aebersold, R., Barry, R. A., Tempst, P., Teplow, D. B., Hood, L. E., Prusiner, S. B., Weissmann, C. A cellular gene encodes scrapie PrP 27-30 protein. Cell. 40, 735-746 (1985)....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
