Isolierung von löslicher und unlöslicher PrP Oligomere in das normale menschliche Gehirn
Summary
Eine neue Art der zellulären Prion-Protein (PrP<sup> C</sup>) Wurde kürzlich in infizierten menschlichen Gehirnen mit den hier beschriebenen Methoden identifiziert worden. Diese Methoden können verwendet werden, um verschiedene PrP-Spezies zu isolieren, während einige von ihnen sind auch nützlich, um anderen fehlgefalteten Proteinaggregate aus menschlichen Gehirnen.
Abstract
Das zentrale Ereignis in der Pathogenese von Prion-Erkrankungen umfasst eine Umwandlung des Host-kodierten zellulären Prionen-Proteins PrP C in seine pathogene Isoform PrP Sc ein. PrP C ist Detergenz-löslichen und empfindlich gegenüber Proteinase K (PK)-Verdau, während PrP Sc bildet Detergens-unlöslichen Aggregaten und ist teilweise resistent gegen PK 2-6. Die Umwandlung von PrP C zu PrP Sc ist bekannt, einen Konformationswechsel α-Helix zu β-Faltblatt-Strukturen des Proteins beinhalten. Jedoch ist die in vivo-Weg noch wenig verstanden. Eine vorläufige endogenen PrP Sc-, Zwischen-PrP * oder "silent Prion", muss noch in der nicht infizierten Gehirn 7 identifiziert werden.
Mit einer Kombination von biophysikalischen und biochemischen Ansätzen haben wir festgestellt, unlösliche PrP C Aggregate (benannt IPRP C) von nicht infizierten Säugetieren Gehirn und kultivierten neuronalenZellen 8, 9. Hier beschreiben wir detaillierter Verfahren dieser Methoden, einschließlich Ultrazentrifugation in Detergenspuffer, Saccharose Stufengradienten Sedimentation, Größenausschlusschromatographie, IPRP Anreicherung durch Gen-5-Protein (g5p), die spezifisch an PrP strukturell veränderten Formen 10 und PK-Behandlung. Die Kombination dieser Ansätze isoliert nicht nur unlösliche PrP Sc und PrP C Aggregate aber auch lösliche Oligomere PrP C von der normalen menschlichen Gehirns. Da die Protokolle hier beschrieben wurden verwendet, um sowohl PrP Sc aus infizierten Gehirnen und IPRP C von nicht infizierten Gehirn zu isolieren, geben sie uns die Möglichkeit, Unterschiede in der physikalisch-chemischen Eigenschaften, Neurotoxizität und Infektiosität zwischen den beiden Isoformen zu vergleichen. Eine solche Studie wird deutlich verbessern unser Verständnis der infektiösen proteinhaltigen Krankheitserreger. Die Physiologie und Pathophysiologie der IPRP C sind derzeit unklar. Insbesondere in einem neu-identified menschlichen Prion-Erkrankung bezeichnet variabel Protease-sensitive prionopathy, fanden wir ein neues PrP Sc, die immunreaktiven Verhalten und Fragmentierung mit IPRP C 11, 12 Aktien. Darüber hinaus haben wir kürzlich gezeigt, dass IPRP C die wichtigsten Arten, die mit Amyloid-β-Protein in Alzheimer-Krankheit 13 zusammenwirkt. In derselben Studie wurden diese Methoden zur Abeta Aggregate und Oligomere in Alzheimer 13 isolieren, was nahelegt, deren Anwendung auf nicht-Prionprotein Aggregate in anderen neurodegenerativen Erkrankungen involviert.
Protocol
Discussion
Die Kombination von Ansätzen über die hier berichtet isoliert konsequent unlöslichen PrP C Aggregate und löslichen PrP C Oligomere aus dem normalen menschlichen Gehirns. Ultrazentrifugation bei 100.000 × g für eine Stunde ist eine klassische Methode, die in großem Maße für die Trennung der unlöslichen PrP Sc von der löslichen PrP C 14 verwendet. Während es effizient ist, eine der Verwarnung ist, um eine Verunreinigung während des Ziehens den Überstand (S2) nach d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken dem menschlichen Gehirn und Rückenmarksflüssigkeit Resource Center (Los Angeles, CA) für die Bereitstellung von normalen Gehirn Muster. Diese Studie wurde von den National Institutes of Health (NIH) R01NS062787, der CJD-Stiftung, Alliance biologisch sicher, sowie die University Center on Aging und Gesundheit mit Unterstützung der McGregor-Stiftung und des Präsidenten Discretionary Fund (Case Western Reserve University) unterstützt .
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride | Sigma-Aldrich | P7626 | 72 mM in 2-propanol |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P2308 | 2 mg/ml in H2O |
| PNGase F | New England Biolabs | MWGF200 | |
| Ultracentrifuge LE-80K, SW55 rotor | Beckman Coulter | Part No. 365668, 356860 | |
| Superdex 200 HR beads | GE Healthcare | 17-1088-01 | |
| AKTA FPLC system | GE Healthcare | 18-1900-26 | |
| Molecular weight markers | Sigma-Aldrich | MWGF200 | Varied |
| Dynabeads M-280 magnetic beads | Invitrogen | 143-01 | |
| 3F4 antibody | Covance | SIG-39600 | |
| 1E4 antibody | Cell Sciences | M1840 | |
| Ready gel 15% Tris-HCl pre-cast gels | Bio-Rad | 345-0020 |
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