Em Eletroporação Ovo na retina de pinto embrionário
Summary
O objetivo geral deste vídeo é mostrar como executar alvo injeção de retina e<em> In ovo</em> Electroporação de ADN / ARN construtos dentro da retina de pinto embrionário no Hamburger e do estágio Hamilton 22-23, o que é de cerca de dia embrionário 4 (E4). Esta técnica é muito útil para estudar a expressão do gene, regulação do gene, e mudança morfológica no desenvolvimento de retina do pintinho.
Abstract
Retina embrionária de galinha é uma excelente ferramenta para estudar o desenvolvimento da retina em vertebrados mais elevados. Por causa de grande tamanho e desenvolvimento externo, ele é comparativamente muito fácil de manipular a retina de pinto embrionário usando recombinante DNA / tecnologia de RNA. Electroporação de ADN / ARN construtos para a retina embrionária têm uma grande vantagem para estudar regulação do gene em retinianas-tronco / progenitoras células durante o desenvolvimento da retina. Tipo diferente de ensaios, tais como ensaio de repórter gene, gene over-expressão, gene knock down (shRNA), etc pode ser realizada utilizando a técnica de electroporação. Este vídeo demonstra alvejado injecção da retina e em eletroporação in ovo dentro da retina de pinto embrionário no Hamburger e do estágio Hamilton 22-23, o que é de cerca de dia embrionário 4 (E4). Aqui nós mostramos uma rápida e conveniente em técnica de eletroporação in ovo através do qual um DNA de plasmídeo que expressa a proteína fluorescente verde (GFP) como um marcador está diretamente entregue napinto espaço sub-retiniano embrionário e seguido por pulsos elétricos para facilitar a absorção de DNA por retina estaminais / progenitoras das células. O novo método de injecção de retina e electroporação em E4 permite a visualização de todos os tipos celulares da retina, incluindo a neurônios tardia-nascido 1, que tem sido difícil com o método convencional da injecção e electroporação em E1.5 2.
Protocol
Discussion
Targeted injecção da retina e em eletroporação in ovo em retina embrionária no estádio de E4 podem objetivar especificamente as células progenitoras da retina, resultando em a habilidade de visualizar todos os seis principais tipos de células da retina no nível da célula única. Em electroporação in ovo em HH10 (~ E1.5) alvejando o vesícula óptica é capaz de transfectar células que se desenvolvem para formar o olho. No entanto, estas células têm um volume de negócio…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer ao Sr. Maaz Enver para o uso de sua câmera HD (Cannon VIXIA HFS100). Este trabalho foi apoiado em parte por concessões do NIH (EY018738), Nova Jersey, Comissão de Pesquisa da Medula Espinhal (08-3074-SCR-E-0 e 10-3091-SCR-E-0), e Prêmio de Pesquisa Biomédica Busch.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Fertilized pathogen-free (SPF) white leghorn chicken eggs | Sunrise Farms (Catskill, NY) | ||
| Chicken egg incubator | GQF manufacturing, Savannah, GA | Model-1550 | Set to 60% humidity and 37.5°C. |
| Glass capillary tubes | World Precision Instrument Inc. | TW150F-4 | |
| 0.1 ml syringe | Hamilton Co. Reno, Nevada | Gastight 1710 | Alternatively 1ml syringe can be used as well |
| Masterflex Silicone (peroxide) Tubing | Cole-Parmer | HV-96400-13 | Cut a small piece (1 cm) for attaching the glass needle to the syringe |
| Tweezers | Dumont | AA | |
| Micromanipulator | World Precision Instrument Inc. | M3301-M3 | |
| Plasmid DNA | pCAG-GFP was borrowed from Dr. Connie Cepko | ||
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252 | Dilute it to 0.025 % with PBS |
| Pulse generator | Harvard Apparatus, MA | BTX ECM 830 | Square wave generator |
| Electrodes | Harvard Apparatus, MA | BTX model 514 | Our electrodes were spaced 3-5 mm apart |
| Monochrome Digital Camera | Zeiss, Germany | Axiocam MRM | |
| Fluorescent Dissection Microscope | Leica Microsystems, Germany | Leica MZ16FA | |
| Upright Fluorescence Microscope | Zeiss, Germany | Zeiss Axio Imager A1 |
References
- Doh, S. T. Analysis of retinal cell development in chick embryo by immunohistochemistry and in ovo electroporation techniques. BMC. Dev. Biol. 10, (2010).
- Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos. J. Vis. Exp. (9), e408-e408 (2007).
- Nakamura, H., Funahashi, J. Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation. Methods. 24, 43-48 (2001).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Dev. Dyn.. 195, 231-272 (1992).
- Hamburger, V. The stage series of the chick embryo. Dev. Dyn. 195, 273-275 (1992).
