In Ovo Elektroporatie in Embryonale Chick Retina
Summary
Het algemene doel van deze video is te laten zien hoe je doelgericht retinale injectie uit te voeren en<em> In ovo</em> Elektroporatie van DNA / RNA-constructen in het kuiken embryonale netvlies aan de Hamburger en Hamilton stadium 22-23, dat is ongeveer embryonale dag 4 (E4). Deze techniek is zeer nuttig om genexpressie, genregulatie, en morfologische veranderingen in de ontwikkeling van Chick netvlies te bestuderen.
Abstract
Kip embryonale netvlies is een uitstekend hulpmiddel om retinale ontwikkeling te bestuderen in hogere gewervelde dieren. Vanwege de grote omvang en externe ontwikkeling, is het relatief zeer makkelijk te manipuleren het kuiken embryonale netvlies met behulp van recombinant-DNA / RNA-technologie. Elektroporatie van DNA / RNA-constructen in het embryonale netvlies hebben een groot voordeel voor genregulatie in het netvlies stam / voorlopercellen tijdens het netvlies ontwikkeling te bestuderen. Verschillende soorten van testen, zoals reporter-gen-test, gen over-expressie, gene knock down (shRNA) enz. kan worden uitgevoerd met behulp van de elektroporatie techniek. Deze video demonstreert gericht retinale injectie en in-ovo elektroporatie in het embryonale kuiken netvlies aan de Hamburger en Hamilton stadium 22-23, dat is ongeveer embryonale dag 4 (E4). Hier laten we een snelle en handig in ovo electroporatie techniek waarbij een plasmide DNA dat green fluorescent protein (GFP) expressie brengt als een marker wordt rechtstreeks geleverd in dechick embryonale subretinale ruimte en gevolgd door elektrische pulsen aan DNA-opname te vergemakkelijken door het netvlies stam / voorlopercellen. De nieuwe methode van retinale injectie en elektroporatie op E4 laat de visualisatie van alle retinale typen cellen, inclusief de late-geboren neuronen 1, die moeilijk is geweest met de conventionele methode van injectie en elektroporatie op E1.5 2.
Protocol
Discussion
Gerichte retinale injectie en in-ovo elektroporatie in embryonale netvlies aan E4 stadium kan specifiek zijn gericht op het netvlies stamcellen resulteert in de mogelijkheid om alle zes grote netvlies celtypen te visualiseren op het cel-niveau. In ovo elektroporatie op HH10 (~ E1.5) gericht op de optic vesicle kan cellen die ontwikkelen om het oog vormen transfecteren. Echter deze cellen hebben een zeer hoge omzet bij deze tijd en deze methode is niet specifiek voor retinale cellen. Het kan zijn dat de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We willen graag aan de heer Maaz Enver bedanken voor het gebruik van zijn HD-camera (Cannon VIXIA HFS100). Dit werk werd mede ondersteund door subsidies van NIH (EY018738), New Jersey Commissie op het ruggenmerg Onderzoek (08 tot 3074-SCR-E-0 en 10 tot 3.091-SCR-E-0), en Busch Biomedical Research Award.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Fertilized pathogen-free (SPF) white leghorn chicken eggs | Sunrise Farms (Catskill, NY) | ||
| Chicken egg incubator | GQF manufacturing, Savannah, GA | Model-1550 | Set to 60% humidity and 37.5°C. |
| Glass capillary tubes | World Precision Instrument Inc. | TW150F-4 | |
| 0.1 ml syringe | Hamilton Co. Reno, Nevada | Gastight 1710 | Alternatively 1ml syringe can be used as well |
| Masterflex Silicone (peroxide) Tubing | Cole-Parmer | HV-96400-13 | Cut a small piece (1 cm) for attaching the glass needle to the syringe |
| Tweezers | Dumont | AA | |
| Micromanipulator | World Precision Instrument Inc. | M3301-M3 | |
| Plasmid DNA | pCAG-GFP was borrowed from Dr. Connie Cepko | ||
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252 | Dilute it to 0.025 % with PBS |
| Pulse generator | Harvard Apparatus, MA | BTX ECM 830 | Square wave generator |
| Electrodes | Harvard Apparatus, MA | BTX model 514 | Our electrodes were spaced 3-5 mm apart |
| Monochrome Digital Camera | Zeiss, Germany | Axiocam MRM | |
| Fluorescent Dissection Microscope | Leica Microsystems, Germany | Leica MZ16FA | |
| Upright Fluorescence Microscope | Zeiss, Germany | Zeiss Axio Imager A1 |
References
- Doh, S. T. Analysis of retinal cell development in chick embryo by immunohistochemistry and in ovo electroporation techniques. BMC. Dev. Biol. 10, (2010).
- Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos. J. Vis. Exp. (9), e408-e408 (2007).
- Nakamura, H., Funahashi, J. Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation. Methods. 24, 43-48 (2001).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Dev. Dyn.. 195, 231-272 (1992).
- Hamburger, V. The stage series of the chick embryo. Dev. Dyn. 195, 273-275 (1992).
