Embriyonik Chick Retina Ovo Elektroporasyon

Summary

Bu videonun genel amacı hedef retina enjeksiyon nasıl gerçekleştirileceği göstermek için ve<em> Ovo</emHamburger ve embriyonik gün 4 (E4) hakkında Hamilton aşamada 22-23, civciv embriyonik retinaya> DNA / RNA yapıları elektroporasyon. Bu teknik, gen ekspresyonu, gen regülasyonu, ve civciv retina gelişmekte olan morfolojik değişimin incelemek için çok yararlıdır.

Abstract

Tavuk embriyonik retinada yüksek omurgalılarda retina gelişimini incelemek için mükemmel bir araçtır. Çünkü büyük ölçekli ve dış gelişme, rekombinant DNA / RNA teknolojisi kullanarak civciv embriyonik retinanın işlemek için nispeten çok kolaydır. Embriyonik retinaya DNA / RNA yapıları Elektroporasyon retina gelişimi sırasında retina kök / progenitör hücrelerin gen regülasyonu incelemek için büyük bir avantaj var. , Bu tür bir reporter gen assay,,-expression üzerinden, gen,, vb.. (ShRNA.) Aşağı doğru için üstüne vurmayın gen gibi deneyleri of Farklı bir type,,, elektroporasyon tekniktir kullanarak gerçekleştirilir uygulanmaz edebilirsiniz. Bu video hedeflenen retina enjeksiyon gösterir ve embriyonik civciv retinaya embriyonik gün 4 (E4) hakkında Hamburger ve Hamilton evre 22-23, ovo elektroporasyon. Bir belirteç olarak yeşil floresan proteininin (GFP) ifade eden bir plazmid DNA doğrudan teslim edilir; Burada, ovo elektroporasyonu tekniği hızlı ve rahat gösterircivciv embriyonik subretinal alan ve retina kök / progenitör hücrelerin DNA alımını kolaylaştırmak için elektrik dalgaları izledi. E4 retina enjeksiyon ve elektroporasyon yeni bir yöntem, E1.5 ² enjeksiyon ve elektroporasyon geleneksel yöntem ile zor olmuştur geç doğumlu nöronlar ^1, dahil olmak üzere tüm retinal hücre türleri, görselleştirme sağlar.

Protocol

,, Daha önceden olarak, minor modifikasyonu ile birlikte,, diğer jove videos 2 ve kağıtlar 3, in açıklanan gibi protokol of, bazı parçalar, gerçekleştirilir uygulanır yılından bu yana, biz, buraya detail in olanlar tartışmak değil edecektir.. 1. Yumurta Taşıma ve İğne Hazırlık Yumurta, yaklaşık 13 ° C'de 1 hafta kadar serin bir şarap muhafaza edilebilir. Sıcaklık çok yüksek ise daha düşük sıcaklık, yüksek mortalite nede…

Discussion

Hedefli retina enjeksiyon ve E4 aşamada embriyonik retinanın ovo elektroporasyon özellikle altı büyük retina hücre tipleri tek hücre düzeyinde görselleştirme becerisi ile sonuçlanan retina progenitör hücreleri hedef. HH10 de ovo elektroporasyon (~ E1.5) hedefleme optik vezikül gözü oluşturacak geliştirmek hücreleri transferinde. Ancak, bu hücreler şu anda çok yüksek bir ciro ve bu yöntemin retina hücreleri için spesifik değildir. Bu yüksek hücre devir hızı, sür…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
Fertilized pathogen-free (SPF) white leghorn chicken eggs	Sunrise Farms (Catskill, NY)
Chicken egg incubator	GQF manufacturing, Savannah, GA	Model-1550	Set to 60% humidity and 37.5°C.
Glass capillary tubes	World Precision Instrument Inc.	TW150F-4
0.1 ml syringe	Hamilton Co. Reno, Nevada	Gastight 1710	Alternatively 1ml syringe can be used as well
Masterflex Silicone (peroxide) Tubing	Cole-Parmer	HV-96400-13	Cut a small piece (1 cm) for attaching the glass needle to the syringe
Tweezers	Dumont	AA
Micromanipulator	World Precision Instrument Inc.	M3301-M3
Plasmid DNA			pCAG-GFP was borrowed from Dr. Connie Cepko
Fast Green FCF	Sigma-Aldrich	F7252	Dilute it to 0.025 % with PBS
Pulse generator	Harvard Apparatus, MA	BTX ECM 830	Square wave generator
Electrodes	Harvard Apparatus, MA	BTX model 514	Our electrodes were spaced 3-5 mm apart
Monochrome Digital Camera	Zeiss, Germany	Axiocam MRM
Fluorescent Dissection Microscope	Leica Microsystems, Germany	Leica MZ16FA
Upright Fluorescence Microscope	Zeiss, Germany	Zeiss Axio Imager A1