I Ovo electroporation i Embryonic Chick Retina

Summary

Det overordnede målet med denne videoen er å vise hvordan man utfører målrettet retinal injeksjon og<em> I ovo</em> Electroporation av DNA / RNA konstruksjoner i chick embryonale netthinnen ved Hamburger og Hamilton scenen 22-23, som handler om embryonale dag 4 (E4). Denne teknikken er veldig nyttig å studere genekspresjon, genregulering, og morfologisk endring i utviklingen chick netthinnen.

Abstract

Kylling embryonale netthinnen er et utmerket verktøy for å studere retinal utvikling i høyere virveldyr. På grunn av stor størrelse og ekstern utvikling, er det forholdsvis lett å manipulere dama embryonale netthinnen ved hjelp av rekombinant DNA / RNA-teknologi. Electroporation av DNA / RNA konstruksjoner inn i embryonale netthinnen har en stor fordel å studere genregulering i netthinnens stamceller / stamceller i løpet av retinal utvikling. Annen type analyser som reporter gen analysen, gen over-uttrykk, genet slå ned (shRNA) etc. kan utføres ved hjelp av electroporation teknikk. Denne videoen viser målrettet retinal injeksjon og i ovo electroporation til embryonale chick netthinnen ved Hamburger og Hamilton scenen 22-23, som handler om embryonale dag 4 (E4). Her viser vi en rask og praktisk i ovo electroporation teknikk der en plasmid DNA som uttrykker grønt fluorescerende protein (GFP) som en markør er direkte levert innchick embryonale subretinal plass og etterfulgt av elektriske pulser til rette DNA opptak av netthinnens stamceller / stamceller. Den nye metoden for retinal injeksjon og electroporation ved E4 tillater visualisering av alle netthinnens celletyper, inkludert sen-fødte ^en nevroner, noe som har vært vanskelig med den konvensjonelle metoden injeksjon og electroporation på E1.5 ^to.

Protocol

Siden deler av protokollen er utført som tidligere beskrevet i andre Jove videoer 2 og papirer 3 med mindre endring vi ikke vil diskutere dem i detalj her. 1. Egg Håndtering og Needle Forberedelse Egg kan lagres i en vin kjøler på ca 13 ° C i opptil en uke. Dersom temperaturen er for høy, vil embryo begynner å utvikle unormalt, mens lavere temperatur fører til høy dødelighet. Når du er klar til å ruge ta ut egg fra vin kjøler og sette eggene vert…

Discussion

Målrettet retinal injeksjon og i ovo electroporation i embryonale netthinnen E4 stadiet kan spesifikt mot netthinnens stamceller resulterer i evnen til å visualisere alle seks store netthinnen celletyper på celle-nivå. I ovo electroporation på HH10 (~ E1.5) rettet mot Optikken vesikkel er i stand til å transfektere celler som utvikler seg til å danne øyet. Men disse cellene har en meget høy omsetning på denne tiden, og denne metoden er ikke spesifikk for netthinnens celler. Det kan være at d…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
Fertilized pathogen-free (SPF) white leghorn chicken eggs	Sunrise Farms (Catskill, NY)
Chicken egg incubator	GQF manufacturing, Savannah, GA	Model-1550	Set to 60% humidity and 37.5°C.
Glass capillary tubes	World Precision Instrument Inc.	TW150F-4
0.1 ml syringe	Hamilton Co. Reno, Nevada	Gastight 1710	Alternatively 1ml syringe can be used as well
Masterflex Silicone (peroxide) Tubing	Cole-Parmer	HV-96400-13	Cut a small piece (1 cm) for attaching the glass needle to the syringe
Tweezers	Dumont	AA
Micromanipulator	World Precision Instrument Inc.	M3301-M3
Plasmid DNA			pCAG-GFP was borrowed from Dr. Connie Cepko
Fast Green FCF	Sigma-Aldrich	F7252	Dilute it to 0.025 % with PBS
Pulse generator	Harvard Apparatus, MA	BTX ECM 830	Square wave generator
Electrodes	Harvard Apparatus, MA	BTX model 514	Our electrodes were spaced 3-5 mm apart
Monochrome Digital Camera	Zeiss, Germany	Axiocam MRM
Fluorescent Dissection Microscope	Leica Microsystems, Germany	Leica MZ16FA
Upright Fluorescence Microscope	Zeiss, Germany	Zeiss Axio Imager A1