الهدف العام من هذا الفيديو هو إظهار كيفية تنفيذ حقن الشبكية المستهدفة و<em> في البيضة</em> electroporation من الحمض النووي / الحمض النووي الريبي يبني في شبكية العين كتكوت الجنينية في هامبورغ وهاملتون مرحلة 22-23، وهي عبارة عن يوم الجنينية 4 (E4). هذه التقنية مفيدة جدا لدراسة التعبير الجيني، تنظيم الجينات، والتغيير الصرفي في تطوير شبكية العين الفرخ.
Abstract
شبكية العين الدجاج الجنينية هو أداة ممتازة لدراسة تطوير شبكية العين في الفقاريات العليا. بسبب الحجم الكبير والتنمية الخارجية، فمن السهل جدا نسبيا لمعالجة شبكية العين كتكوت الجنينية باستخدام المؤتلف DNA / RNA التكنولوجيا. Electroporation من الحمض النووي / الحمض النووي الريبي في البنى الشبكية الجنينية تتمتع بميزة كبيرة لدراسة تنظيم الجينات في الخلايا الجذعية / السلف في شبكية العين خلال تطوير شبكية العين. لا يمكن أن يؤديها نوع مختلف من فحوصات مثل فحص الجينات المراسل، جين الافراط في التعبير، والجينات بهدم (shRNA) وما إلى ذلك باستخدام تقنية electroporation. هذا الفيديو يشرح حقن في شبكية العين، واستهدفت في electroporation البيضة في شبكية العين كتكوت الجنينية في هامبورغ وهاملتون مرحلة 22-23، وهي عبارة عن يوم الجنينية 4 (E4). هنا نعرض سريعة ومريحة في تقنية electroporation البيضة حيث يتم تسليمها مباشرة البلازميد التي تعبر عن بروتين الفلورية الخضراء (GFP) كعلامة فيكتكوت الجنينية الفضاء تحت الشبكية وتليها نبضات كهربائية لتسهيل امتصاص الحمض النووي عن طريق الخلايا الجذعية / السلف في شبكية العين. طريقة جديدة للحقن في شبكية العين وelectroporation في E4 يسمح التصور من جميع أنواع الخلايا في شبكية العين، بما في ذلك الخلايا العصبية في وقت متأخر من مواليد 1، والتي كان من الصعب مع الأسلوب التقليدي للحقن وelectroporation في E1.5 2.
Protocol
منذ يتم تنفيذ بعض أجزاء من بروتوكول كما هو موضح سابقا في أشرطة الفيديو وغيرها [جوف] 2 و 3 ورقات مع تعديلات طفيفة لن نناقش هذه بالتفصيل هنا. 1. التعامل مع البيض وتحضير الإبرة <li style=";text-align:right;direction:rt…
Discussion
استهدفت حقن في شبكية العين وelectroporation البيضة في شبكية العين في المرحلة الجنينية E4 يمكن أن تستهدف على وجه التحديد الخلايا الاصلية في شبكية العين مما يؤدي إلى القدرة على تصور كل خلية شبكية العين 6 أنواع رئيسية على مستوى خلية واحدة. في electroporation البيضة في HH10 (…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر السيد معاذ أنور لاستخدام كاميرا HD له (كانون VIXIA HFS100). وأيد هذا العمل في جزء من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة (EY018738)، نيو جيرسي جنة البحوث الحبل الشوكي (08-3074-SCR-E-0 و 10-3091-SCR-0-E)، وبوش جائزة بحوث الطبية الحيوية.
Materials
Name of the reagent
Company
Catalogue number
Comments
Fertilized pathogen-free (SPF) white leghorn chicken eggs
Sunrise Farms (Catskill, NY)
Chicken egg incubator
GQF manufacturing, Savannah, GA
Model-1550
Set to 60% humidity and 37.5°C.
Glass capillary tubes
World Precision Instrument Inc.
TW150F-4
0.1 ml syringe
Hamilton Co. Reno, Nevada
Gastight 1710
Alternatively 1ml syringe can be used as well
Masterflex Silicone (peroxide) Tubing
Cole-Parmer
HV-96400-13
Cut a small piece (1 cm) for attaching the glass needle to the syringe