在OVO在鸡胚视网膜电穿孔
Summary
该视频的总体目标是显示如何执行有针对性的视网膜注射<em>在OVO</em> DNA / RNA的结构，在汉堡包和汉密尔顿22-23阶段，这是关于胚胎第4天（E4），成鸡胚胎视网膜电。这种技术是非常有用的，以研究基因表达，基因调控，并在发展中国家小鸡视网膜的形态学变化。
Abstract
鸡胚胎的视网膜是一个很好的工具来研究在高等脊椎动物的视网膜发育。由于庞大的规模和外部的发展，它是相对非常容易操纵的鸡胚视网膜，利用重组DNA / RNA技术。胚胎视网膜电DNA / RNA的结构将有一个很大的优势，研究视网膜发育过程中视网膜干/祖细胞的基因调控。如检测报告基因检测，基因过度表达，基因敲除（shRNA的）等不同类型，可以使用电穿孔技术。该视频演示了有针对性的视网膜注射到鸡胚视网膜OVO在汉堡和汉密尔顿阶段22-23，这是关于胚胎第4天（E4），电。在这里，我们表明在OVO电技术的快速和便捷，使质粒DNA的表达绿色荧光蛋白（GFP）作为标记直接传递到鸡胚视网膜下的空间和通过电脉冲，以促进视网膜干/祖细胞的DNA吸收。视网膜注射和电E4类的新方法，让所有的视网膜细胞类型的可视化，包括后期新生神经元，这一直是注射和电的传统方法难以在E1.5 2。
Protocol
Discussion
有针对性的视网膜注射，并在 E4类阶段OVO在胚胎视网膜电针对视网膜祖细胞，导致在单细胞水平上的所有六个主要的视网膜细胞类型的能力，可视化。 在OVO电在HH10（E1.5）针对视泡是能够转染细胞的发展，形成了眼。然而，这些细胞具有非常高的营业额，在这个时候，这种方法是不特定的视网膜细胞。这可能是高的细胞周转率，防止持续稳定表达。由E4时，胚胎不够发达，眼?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们要感谢他的高清摄像头（炮VIXIA HFS100）使用玛斯恩维尔先生。这项工作是支持的，一部分由来自NIH的“（EY018738），新泽西州的脊髓研究委员会（08-3074-可控硅 – E-0和10-3091-SCR-E 0），布希生物医学研究奖补助。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Fertilized pathogen-free (SPF) white leghorn chicken eggs | Sunrise Farms (Catskill, NY) | ||
| Chicken egg incubator | GQF manufacturing, Savannah, GA | Model-1550 | Set to 60% humidity and 37.5°C. |
| Glass capillary tubes | World Precision Instrument Inc. | TW150F-4 | |
| 0.1 ml syringe | Hamilton Co. Reno, Nevada | Gastight 1710 | Alternatively 1ml syringe can be used as well |
| Masterflex Silicone (peroxide) Tubing | Cole-Parmer | HV-96400-13 | Cut a small piece (1 cm) for attaching the glass needle to the syringe |
| Tweezers | Dumont | AA | |
| Micromanipulator | World Precision Instrument Inc. | M3301-M3 | |
| Plasmid DNA | pCAG-GFP was borrowed from Dr. Connie Cepko | ||
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252 | Dilute it to 0.025 % with PBS |
| Pulse generator | Harvard Apparatus, MA | BTX ECM 830 | Square wave generator |
| Electrodes | Harvard Apparatus, MA | BTX model 514 | Our electrodes were spaced 3-5 mm apart |
| Monochrome Digital Camera | Zeiss, Germany | Axiocam MRM | |
| Fluorescent Dissection Microscope | Leica Microsystems, Germany | Leica MZ16FA | |
| Upright Fluorescence Microscope | Zeiss, Germany | Zeiss Axio Imager A1 |
References
- Doh, S. T. Analysis of retinal cell development in chick embryo by immunohistochemistry and in ovo electroporation techniques. BMC. Dev. Biol. 10, (2010).
- Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos. J. Vis. Exp. (9), e408-e408 (2007).
- Nakamura, H., Funahashi, J. Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation. Methods. 24, 43-48 (2001).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Dev. Dyn.. 195, 231-272 (1992).
- Hamburger, V. The stage series of the chick embryo. Dev. Dyn. 195, 273-275 (1992).
