I Ovo Elektroporation i embryonisk Chick Retina

Summary

Det overordnede mål for denne video er at vise, hvordan du udfører målrettet retinal injektion og<em> In ovo</em> Elektroporering af DNA / RNA konstrukter ind i kyllingens embryoniske retina i det Hamburger og Hamilton stadium 22-23, hvilket er omkring embryonisk dag 4 (E4). Denne teknik er meget nyttigt at undersøge genekspression, genregulering, og morfologiske forandringer i udviklingen af ​​chick nethinden.

Abstract

Kylling embryonale nethinden er et fremragende værktøj til at studere retinal udvikling i højere hvirveldyr. Grund af store størrelse og ekstern udvikling, er det forholdsvis meget nemt at manipulere den chick embryoniske nethinden anvendelse af rekombinant DNA / RNA-teknologi. Elektroporering af DNA / RNA konstrukter ind i den embryoniske nethinden have en stor fordel at studere genregulering i retinale stamceller / progenitor celler under retinal udviklingen. Forskellig type af assays såsom reportergen assay, gen over-ekspression, knock genet ned (shRNA) etc. kan udføres ved anvendelse af elektroporation teknikken. Denne video demonstrerer målrettede retinal indsprøjtning og in ovo elektroporering ind i den embryoniske kylling retina i det Hamburger og Hamilton stadium 22-23, hvilket er omkring embryonisk dag 4 (E4). Her viser vi en hurtig og bekvem in ovo elektroporering teknik, hvorved en plasmid-DNA der udtrykker grønt fluorescerende protein (GFP) som en markør bliver direkte leveres ind ichick embryonisk subretinale rum og efterfulgt af elektriske impulser at lette DNA-optagelse ved retinale stam / progenitor celler. Den nye metode til retinal injektion og elektroporation ved E4 tillader visualisering af alle retinale celletyper, herunder den sene-fødte neuroner ^1, som har været vanskeligt med den konventionelle metode af injektion og elektroporation ved E1.5 ^2.

Protocol

Da nogle dele af protokollen udføres som tidligere beskrevet i andre Jové videoer 2 og papirer 3 med mindre ændringer, vil vi ikke diskutere dem i detaljer her. 1. Æg Håndtering og Needle Forberedelse Æg kan lagres i en vin køligere ved ca 13 ° C i op til 1 uge. Hvis temperaturen er for høj, vil embryoner begynde at udvikle unormalt, medens lavere temperatur forårsager høj dødelighed. Når du er klar til at inkubere tage æggene fra vinkøler og s…

Discussion

Målrettet retinal injektion og i ovo elektroporation i embryonale nethinden E4 tidspunkt kan målrette retinale stamceller, hvilket resulterer i evnen til at visualisere alle de seks store nethinden celletyper på enkelt celle niveau. I ovo elektroporation i HH10 (~ E1.5) rettet mod optic vesikel er i stand til transficere celler der udvikler til dannelse øjet. Imidlertid, disse celler have en meget høj omsætning på dette tidspunkt og denne metode er ikke specifik for retinale celler. Det kan vær…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
Fertilized pathogen-free (SPF) white leghorn chicken eggs	Sunrise Farms (Catskill, NY)
Chicken egg incubator	GQF manufacturing, Savannah, GA	Model-1550	Set to 60% humidity and 37.5°C.
Glass capillary tubes	World Precision Instrument Inc.	TW150F-4
0.1 ml syringe	Hamilton Co. Reno, Nevada	Gastight 1710	Alternatively 1ml syringe can be used as well
Masterflex Silicone (peroxide) Tubing	Cole-Parmer	HV-96400-13	Cut a small piece (1 cm) for attaching the glass needle to the syringe
Tweezers	Dumont	AA
Micromanipulator	World Precision Instrument Inc.	M3301-M3
Plasmid DNA			pCAG-GFP was borrowed from Dr. Connie Cepko
Fast Green FCF	Sigma-Aldrich	F7252	Dilute it to 0.025 % with PBS
Pulse generator	Harvard Apparatus, MA	BTX ECM 830	Square wave generator
Electrodes	Harvard Apparatus, MA	BTX model 514	Our electrodes were spaced 3-5 mm apart
Monochrome Digital Camera	Zeiss, Germany	Axiocam MRM
Fluorescent Dissection Microscope	Leica Microsystems, Germany	Leica MZ16FA
Upright Fluorescence Microscope	Zeiss, Germany	Zeiss Axio Imager A1