L'objectif global de cette vidéo est de montrer comment effectuer l'injection ciblée de la rétine et<em> In ovo</emÉlectroporation> de l'ADN / ARN des constructions dans la rétine de poulet embryonnaire au Hamburger et le stade de Hamilton 22-23, ce qui représente environ jour embryonnaire 4 (E4). Cette technique est très utile pour étudier l'expression des gènes, la régulation des gènes, et les changements morphologiques dans le développement de la rétine de poulet.
Abstract
Rétine de poulet embryonnaire est un excellent outil pour étudier le développement de la rétine chez les vertébrés supérieurs. Parce que de grande taille et de développement externe, il est relativement très facile de manipuler la rétine de poulet embryonnaire en utilisant l'ADN recombinant / technologie de l'ARN. L'électroporation de l'ADN / ARN des constructions dans la rétine embryonnaire ont un grand avantage pour étudier la régulation des gènes dans la rétine cellules souches / progénitrices au cours du développement de la rétine. Différents types de tests tels que dosage du gène rapporteur, gène sur-expression, le gène abattre (shRNA), etc peut être réalisée en utilisant la technique d'électroporation. Cette vidéo montre ciblé d'injection de la rétine et dans électroporation in ovo dans la rétine de poulet embryonnaire au stade de Hamburger et Hamilton 22-23, ce qui représente environ jour embryonnaire 4 (E4). Ici, nous montrons une réponse rapide et pratique dans lequel technique d'électroporation in ovo un ADN plasmidique qui exprime la protéine fluorescente verte (GFP) comme un marqueur est livré directement dans lapoussin embryonnaire espace sous-rétinien et suivie par des impulsions électriques pour faciliter l'absorption de l'ADN par la rétine cellules souches / progénitrices. La nouvelle méthode d'injection de la rétine et l'électroporation à E4 permet la visualisation de tous les types de cellules rétiniennes, y compris la fin de neurones d'origine 1, qui a été difficile avec la méthode conventionnelle de l'injection et l'électroporation à E1.5 2.
Protocol
Depuis quelques parties du protocole sont réalisées comme décrit précédemment dans d'autres vidéos et des documents de Jove 2 3 avec des modifications mineures, nous ne discuterons pas ceux en détail ici. 1. La manipulation des œufs et de Préparation à aiguilles Les œufs peuvent être stockés dans un refroidisseur de vin à environ 13 ° C pendant 1 semaine. Si la température est trop élevée, les embryons commence à se développer anormalement, tandi…
Discussion
Ciblée de la rétine et d'injection in ovo dans électroporation dans la rétine embryonnaire au stade E4 peut cibler spécifiquement les cellules progénitrices la rétine dues à la capacité de visualiser tous les six principaux types de cellules rétiniennes au niveau de la cellule unique. En électroporation in ovo à HH10 (~ E1.5) ciblant le vésicule optique est capable de transfecter des cellules qui se développent pour former l'œil. Cependant, ces cellules ont un chiffre d&…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier M. Enver Maaz pour l'utilisation de son appareil photo HD (Cannon VIXIA HFS100). Ce travail a été soutenu en partie par des subventions des NIH (EY018738), New Jersey Commission sur la recherche sur la moelle épinière (08-3074-RCS-E-0 et 10-3091-RCS-E-0), et le Prix Busch recherche biomédicale.
Materials
Name of the reagent
Company
Catalogue number
Comments
Fertilized pathogen-free (SPF) white leghorn chicken eggs
Sunrise Farms (Catskill, NY)
Chicken egg incubator
GQF manufacturing, Savannah, GA
Model-1550
Set to 60% humidity and 37.5°C.
Glass capillary tubes
World Precision Instrument Inc.
TW150F-4
0.1 ml syringe
Hamilton Co. Reno, Nevada
Gastight 1710
Alternatively 1ml syringe can be used as well
Masterflex Silicone (peroxide) Tubing
Cole-Parmer
HV-96400-13
Cut a small piece (1 cm) for attaching the glass needle to the syringe