Das übergeordnete Ziel dieses Videos ist zu zeigen, wie die gezielte Injektion Netzhaut führen und<em> In-ovo-</em> Elektroporation von DNA / RNA-Konstrukten in das Küken embryonalen Netzhaut an der Hamburger und Hamilton Stadium 22-23, die etwa embryonalen Tag 4 (E4) ist. Diese Technik ist sehr nützlich, um die Genexpression, Genregulation und morphologische Veränderung bei der Entwicklung Hühnchenretina studieren.
Abstract
Huhn embryonalen Netzhaut ist ein ausgezeichnetes Werkzeug zur Entwicklung der Retina bei höheren Wirbeltieren zu studieren. Aufgrund der Größe und externen Entwicklung ist es vergleichsweise sehr einfach, die Küken embryonalen Netzhaut mittels rekombinanter DNA / RNA-Technologie zu manipulieren. Elektroporation von DNA / RNA-Konstrukte in der embryonalen Retina haben einen großen Vorteil, um Genregulation in retinalen Stammzellen / Vorläuferzellen während der Entwicklung der Retina zu untersuchen. Verschiedene Arten von Assays wie Reportergenassay, Gen-Überexpression, Gen niederschlagen (shRNA) etc. kann mit Hilfe der Elektroporation Technik werden. Dieses Video demonstriert gezielte Einspritz-und Retina-in-ovo-Elektroporation in die embryonale Hühnchenretina in der Hamburger und Hamilton Stadium 22-23, die etwa embryonalen Tag 4 (E4) ist. Hier zeigen wir eines schnellen und komfortablen in-ovo-Elektroporation Technik, bei der eine Plasmid-DNA, die grün fluoreszierendes Protein (GFP) drückt als Marker wird direkt in die gelieferteKükenembryonen subretinalen Raum, gefolgt von elektrischen Impulsen zur DNA-Aufnahme durch Netzhaut-Stammzellen / Vorläuferzellen zu erleichtern. Die neue Methode der retinalen Injektion und Elektroporation auf E4 ermöglicht die Visualisierung der einzelnen retinalen Zelltypen, einschließlich der spätgeborene Neuronen 1, die schwierig gewesen ist mit dem herkömmlichen Verfahren der Injektion und Elektroporation bei E1.5 2.
Protocol
Da einige Teile des Protokolls durchgeführt werden als zuvor in anderen JoVE Videos 2 und 3 Papiere mit geringen Modifikationen beschrieben werden wir nicht zu diskutieren, die hier im Detail. 1. Egg Handhabung und Zubereitung Needle Eier können in einem Wein gelagert-Kühler werden bei etwa 13 ° C für bis zu 1 Gespräch. Wenn die Temperatur zu hoch ist, werden Embryonen anfangen, abnormal entwickeln, während niedrigere Temperatur bewirkt eine hohe Morta…
Discussion
Gezielte Injektion Netzhaut und in ovo Elektroporation in embryonale Retina bei E4 Bühne können gezielt retinalen Vorläuferzellen was in der Fähigkeit, alle sechs großen Netzhaut Zelltypen auf der Ebene einzelner Zellen sichtbar zu machen. In ovo Elektroporation bei HH10 (~ E1.5), deren Zielgruppe die Augenblase ist in der Lage, Zellen, die um das Auge bilden entwickeln transfizieren. Jedoch haben diese Zellen eine sehr hohe Fluktuation in dieser Zeit und dieses Verfahren ist nicht spezifisch für…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Herrn Maaz Enver für die Nutzung seiner HD-Kamera (Cannon VIXIA HFS100) zu danken. Diese Arbeit wurde zum Teil durch Zuschüsse von NIH (EY018738), New Jersey Kommission über die Spinal Cord Research (08 bis 3074-SCR-E-0 und 10-3091-SCR-E-0), und Busch Biomedical Research Award unterstützt.
Materials
Name of the reagent
Company
Catalogue number
Comments
Fertilized pathogen-free (SPF) white leghorn chicken eggs
Sunrise Farms (Catskill, NY)
Chicken egg incubator
GQF manufacturing, Savannah, GA
Model-1550
Set to 60% humidity and 37.5°C.
Glass capillary tubes
World Precision Instrument Inc.
TW150F-4
0.1 ml syringe
Hamilton Co. Reno, Nevada
Gastight 1710
Alternatively 1ml syringe can be used as well
Masterflex Silicone (peroxide) Tubing
Cole-Parmer
HV-96400-13
Cut a small piece (1 cm) for attaching the glass needle to the syringe