ב electroporation לג'ימי ברשתית צ'יק עובריים
Summary
המטרה הכללית של סרט זה היא להראות כיצד לבצע הזרקת רשתית ממוקד<em> ב לג'ימי</em> Electroporation של DNA / RNA בונה לתוך הרשתית חומוס העוברית על המבורגר ושלב המילטון 22-23, שזה בערך יום עובריים 4 (E4). טכניקה זו שימושית מאוד ללמוד ביטוי גנים, ויסות הגנים, ושינוי מורפולוגי בפיתוח הרשתית חומוס.
Abstract
הרשתית עוף העוברית היא כלי מצוין ללמוד פיתוח רשתית בבעלי חוליות גבוהות יותר. בגלל גודל גדול ופיתוח חיצוני, זה יחסית קל מאוד לתפעל את הרשתית חומוס עובריים באמצעות ה-DNA רקומביננטי / טכנולוגיית RNA. Electroporation של DNA / RNA בונה לתוך הרשתית עובריים יש יתרון גדול ללמוד ויסות הגנים בגזע / אבי תאים ברשתית במהלך התפתחות הרשתית. סוג אחר של מבחני כגון assay כתב הגן, הגן על הביטוי, הגן להפיל (shRNA) וכו 'ניתן לבצע באמצעות טכניקה electroporation. סרט הווידאו הזה מדגים הזרקת רשתית ממוקד ב electroporation לג'ימי לתוך הרשתית חומוס העוברית על המבורגר והמילטון בשלב 22-23, שזה בערך יום עובריים 4 (E4). כאן אנו מראים מהירה ונוחה בטכניקה electroporation לג'ימי לפיה DNA פלסמיד המבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) כסמן מועבר ישירותחומוס עובריים שטח subretinal ואחריו פולסים חשמליים כדי להקל על קליטת ה-DNA על ידי גזע / אבי תאים ברשתית. שיטה חדשה של הזרקת electroporation רשתית ב E4 מאפשר הדמיה של כל סוגי תאים ברשתית, כולל המנוח, יליד נוירונים 1, אשר היה קשה עם השיטה המקובלת של הזרקת electroporation על E1.5 2.
Protocol
Discussion
ממוקד הזרקת ברשתית וב electroporation לג'ימי ברשתית עוברית בשלב E4 יכול ממוקדת ובתאים הרשתית וכתוצאה מכך היכולת לחזות את כל ששת סוגי התאים העיקריים רשתית ברמת תא בודד. ב electroporation לג'ימי ב HH10 (~ E1.5) מיקוד שלפוחית הראיה הוא מסוגל transfect תאים המתפתחים כדי …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות למר Maaz אנוור לשימוש של המצלמה שלו HD (קנון VIXIA HFS100). עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי תרומות של NIH (EY018738), ניו ג'רזי ועדת המחקר של חוט השדרה (08-3074-SCR-E-0 ו 10-3091-SCR-E-0), ובוש פרס Biomedical Research.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Fertilized pathogen-free (SPF) white leghorn chicken eggs | Sunrise Farms (Catskill, NY) | ||
| Chicken egg incubator | GQF manufacturing, Savannah, GA | Model-1550 | Set to 60% humidity and 37.5°C. |
| Glass capillary tubes | World Precision Instrument Inc. | TW150F-4 | |
| 0.1 ml syringe | Hamilton Co. Reno, Nevada | Gastight 1710 | Alternatively 1ml syringe can be used as well |
| Masterflex Silicone (peroxide) Tubing | Cole-Parmer | HV-96400-13 | Cut a small piece (1 cm) for attaching the glass needle to the syringe |
| Tweezers | Dumont | AA | |
| Micromanipulator | World Precision Instrument Inc. | M3301-M3 | |
| Plasmid DNA | pCAG-GFP was borrowed from Dr. Connie Cepko | ||
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252 | Dilute it to 0.025 % with PBS |
| Pulse generator | Harvard Apparatus, MA | BTX ECM 830 | Square wave generator |
| Electrodes | Harvard Apparatus, MA | BTX model 514 | Our electrodes were spaced 3-5 mm apart |
| Monochrome Digital Camera | Zeiss, Germany | Axiocam MRM | |
| Fluorescent Dissection Microscope | Leica Microsystems, Germany | Leica MZ16FA | |
| Upright Fluorescence Microscope | Zeiss, Germany | Zeiss Axio Imager A1 |
References
- Doh, S. T. Analysis of retinal cell development in chick embryo by immunohistochemistry and in ovo electroporation techniques. BMC. Dev. Biol. 10, (2010).
- Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos. J. Vis. Exp. (9), e408-e408 (2007).
- Nakamura, H., Funahashi, J. Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation. Methods. 24, 43-48 (2001).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Dev. Dyn.. 195, 231-272 (1992).
- Hamburger, V. The stage series of the chick embryo. Dev. Dyn. 195, 273-275 (1992).
