भ्रूण चिकी रेटिना में ओवो electroporation में
Summary
इस वीडियो के समग्र लक्ष्य को दिखाने के लिए कैसे लक्षित रेटिना इंजेक्शन के प्रदर्शन करने के लिए है और<em> ओवो में</emहैम्बर्गर और हैमिल्टन 22-23 मंच है, जो भ्रूण 4 दिन (E4) के बारे में है पर लड़की भ्रूण रेटिना में डीएनए / आरएनए constructs electroporation. यह तकनीक बहुत जीन अभिव्यक्ति जीन विनियमन, और लड़की रेटिना के विकास में रूपात्मक बदलाव का अध्ययन करने के लिए उपयोगी है.
Abstract
चिकन भ्रूण रेटिना उच्च रीढ़ में रेटिना विकास का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट उपकरण है. बड़े आकार और बाहरी विकास की वजह से, यह अपेक्षाकृत बहुत आसान है लड़की भ्रूण पुनः संयोजक डीएनए / आरएनए प्रौद्योगिकी का उपयोग रेटिना में हेरफेर. डीएनए / आरएनए constructs के भ्रूण रेटिना में electroporation स्टेम / पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं रेटिना के में रेटिनल विकास के दौरान जीन विनियमन का अध्ययन करने के लिए एक महान लाभ है. रिपोर्टर जीन परख, अभिव्यक्ति से अधिक जीन, जीन नीचे दस्तक (shRNA) आदि के रूप में assays के विभिन्न प्रकार electroporation तकनीक का उपयोग किया जा सकता है. इस वीडियो लक्षित रेटिना इंजेक्शन को दर्शाता है और भ्रूण लड़की रेटिना में ओवो electroporation में हैम्बर्गर और हैमिल्टन 22-23 मंच, जो भ्रूण 4 दिन (E4) के बारे में है. यहाँ हम ओवो electroporation तकनीक में तेजी और सुविधाजनक शो जिससे एक प्लास्मिड डीएनए है कि एक मार्कर के रूप में हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) व्यक्त सीधे में कर दिया हैलड़की भ्रूण subretinal अंतरिक्ष और बिजली दालों के बाद रेटिना स्टेम / पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं के डीएनए तेज की सुविधा. रेटिना और E4 पर इंजेक्शन electroporation की नई विधि देर जन्मे 1 न्यूरॉन्स, जो इंजेक्शन और electroporation की पारंपरिक विधि के साथ मुश्किल 2 E1.5 पर किया गया है सहित सभी रेटिना सेल प्रकार, दृश्य की अनुमति देता है.
Protocol
Discussion
रेटिना इंजेक्शन लक्षित और E4 के स्तर पर भ्रूण रेटिना में ओवो electroporation में विशेष रूप से एकल कोशिका के स्तर पर सभी छह प्रमुख रेटिना सेल प्रकार की कल्पना करने की क्षमता में जिसके परिणामस्वरूप रेटिनल पू…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम अपने HD कैमरा का उपयोग (तोप VIXIA HFS100) के लिए श्री Maaz Enver धन्यवाद देना चाहूंगा. इस काम के भाग में (EY018738) एनआईएच, स्पाइनल कॉर्ड अनुसंधान पर न्यू जर्सी आयोग (08-3074-SCR ई 0 और 10-3091-SCR-ई 0), और Busch जैव चिकित्सा अनुसंधान पुरस्कार से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Fertilized pathogen-free (SPF) white leghorn chicken eggs | Sunrise Farms (Catskill, NY) | ||
| Chicken egg incubator | GQF manufacturing, Savannah, GA | Model-1550 | Set to 60% humidity and 37.5°C. |
| Glass capillary tubes | World Precision Instrument Inc. | TW150F-4 | |
| 0.1 ml syringe | Hamilton Co. Reno, Nevada | Gastight 1710 | Alternatively 1ml syringe can be used as well |
| Masterflex Silicone (peroxide) Tubing | Cole-Parmer | HV-96400-13 | Cut a small piece (1 cm) for attaching the glass needle to the syringe |
| Tweezers | Dumont | AA | |
| Micromanipulator | World Precision Instrument Inc. | M3301-M3 | |
| Plasmid DNA | pCAG-GFP was borrowed from Dr. Connie Cepko | ||
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252 | Dilute it to 0.025 % with PBS |
| Pulse generator | Harvard Apparatus, MA | BTX ECM 830 | Square wave generator |
| Electrodes | Harvard Apparatus, MA | BTX model 514 | Our electrodes were spaced 3-5 mm apart |
| Monochrome Digital Camera | Zeiss, Germany | Axiocam MRM | |
| Fluorescent Dissection Microscope | Leica Microsystems, Germany | Leica MZ16FA | |
| Upright Fluorescence Microscope | Zeiss, Germany | Zeiss Axio Imager A1 |
References
- Doh, S. T. Analysis of retinal cell development in chick embryo by immunohistochemistry and in ovo electroporation techniques. BMC. Dev. Biol. 10, (2010).
- Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos. J. Vis. Exp. (9), e408-e408 (2007).
- Nakamura, H., Funahashi, J. Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation. Methods. 24, 43-48 (2001).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Dev. Dyn.. 195, 231-272 (1992).
- Hamburger, V. The stage series of the chick embryo. Dev. Dyn. 195, 273-275 (1992).
