In elettroporazione Ovo in Retina Chick Embryonic
Summary
L'obiettivo generale di questo video è quello di mostrare come eseguire l'iniezione mirata della retina e<em> In ovo</emElettroporazione> del DNA / RNA costrutti nella retina pulcino embrionale alla Hamburger e lo stadio Hamilton 22-23, che è di circa 4 giorni embrionale (E4). Questa tecnica è molto utile per studio dell'espressione genica, regolazione genica, e cambiamento morfologico in sviluppo retina pulcino.
Abstract
Retina embrionale di pollo è un ottimo strumento per studiare lo sviluppo della retina nei vertebrati superiori. Causa delle grandi dimensioni e sviluppo esterna, è comparativamente molto facile manipolare la retina embrionale pulcino usando ricombinante DNA / tecnologia RNA. Elettroporazione del DNA / RNA costrutti nella retina embrionale hanno un grande vantaggio per lo studio della retina regolazione genica in cellule staminali / progenitrici durante lo sviluppo della retina. Diverso tipo di saggi quali saggio gene reporter, genica sovra-espressione, gene abbattere (shRNA) ecc può essere eseguita utilizzando la tecnica elettroporazione. Questo video dimostra l'iniezione mirata della retina e in elettroporazione ovo nella retina pulcino embrionale alla Hamburger e Hamilton fase di 22-23, che è di circa 4 giorni embrionale (E4). Qui mostriamo una rapida e conveniente in tecnica elettroporazione ovo quale un DNA plasmide che esprime proteina verde fluorescente (GFP) come marcatore viene consegnato direttamente nelpulcino embrionale spazio sottoretinico e seguiti da impulsi elettrici per facilitare l'assorbimento del DNA da parte della retina cellule staminali / progenitrici. Il nuovo metodo di iniezione retinica ed elettroporazione presso E4 permette la visualizzazione di tutti i tipi di cellule retiniche, compreso il tardo-nato neuroni 1, che è stato difficile con il metodo convenzionale di iniezione ed elettroporazione a E1.5 2.
Protocol
Discussion
L'iniezione mirata della retina e in elettroporazione ovo in retina embrionale allo stadio E4 possono specificatamente colpire le cellule progenitrici della retina conseguente la capacità di visualizzare tutti e sei i principali tipi di cellule della retina a livello di singola cellula. In elettroporazione ovo a HH10 (~ E1.5) rivolte alla vescicola ottica è in grado di trasfettare cellule che si sviluppano a formare l'occhio. Tuttavia, queste cellule hanno un fatturato molto…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare il Sig. Maaz Enver per l'utilizzo della sua macchina fotografica HD (Cannon VIXIA HFS100). Questo lavoro è stato sostenuto in parte da sovvenzioni dal NIH (EY018738), New Jersey Commissione per la ricerca del Midollo Spinale (08-3074-SCR-E-0 e 10-3091-SCR-E-0), e Busch Award Ricerca Biomedica.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Fertilized pathogen-free (SPF) white leghorn chicken eggs | Sunrise Farms (Catskill, NY) | ||
| Chicken egg incubator | GQF manufacturing, Savannah, GA | Model-1550 | Set to 60% humidity and 37.5°C. |
| Glass capillary tubes | World Precision Instrument Inc. | TW150F-4 | |
| 0.1 ml syringe | Hamilton Co. Reno, Nevada | Gastight 1710 | Alternatively 1ml syringe can be used as well |
| Masterflex Silicone (peroxide) Tubing | Cole-Parmer | HV-96400-13 | Cut a small piece (1 cm) for attaching the glass needle to the syringe |
| Tweezers | Dumont | AA | |
| Micromanipulator | World Precision Instrument Inc. | M3301-M3 | |
| Plasmid DNA | pCAG-GFP was borrowed from Dr. Connie Cepko | ||
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252 | Dilute it to 0.025 % with PBS |
| Pulse generator | Harvard Apparatus, MA | BTX ECM 830 | Square wave generator |
| Electrodes | Harvard Apparatus, MA | BTX model 514 | Our electrodes were spaced 3-5 mm apart |
| Monochrome Digital Camera | Zeiss, Germany | Axiocam MRM | |
| Fluorescent Dissection Microscope | Leica Microsystems, Germany | Leica MZ16FA | |
| Upright Fluorescence Microscope | Zeiss, Germany | Zeiss Axio Imager A1 |
References
- Doh, S. T. Analysis of retinal cell development in chick embryo by immunohistochemistry and in ovo electroporation techniques. BMC. Dev. Biol. 10, (2010).
- Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos. J. Vis. Exp. (9), e408-e408 (2007).
- Nakamura, H., Funahashi, J. Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation. Methods. 24, 43-48 (2001).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Dev. Dyn.. 195, 231-272 (1992).
- Hamburger, V. The stage series of the chick embryo. Dev. Dyn. 195, 273-275 (1992).
