O objetivo geral deste vídeo é mostrar como executar alvo injeção de retina e<em> In ovo</em> Electroporação de ADN / ARN construtos dentro da retina de pinto embrionário no Hamburger e do estágio Hamilton 22-23, o que é de cerca de dia embrionário 4 (E4). Esta técnica é muito útil para estudar a expressão do gene, regulação do gene, e mudança morfológica no desenvolvimento de retina do pintinho.
Abstract
Retina embrionária de galinha é uma excelente ferramenta para estudar o desenvolvimento da retina em vertebrados mais elevados. Por causa de grande tamanho e desenvolvimento externo, ele é comparativamente muito fácil de manipular a retina de pinto embrionário usando recombinante DNA / tecnologia de RNA. Electroporação de ADN / ARN construtos para a retina embrionária têm uma grande vantagem para estudar regulação do gene em retinianas-tronco / progenitoras células durante o desenvolvimento da retina. Tipo diferente de ensaios, tais como ensaio de repórter gene, gene over-expressão, gene knock down (shRNA), etc pode ser realizada utilizando a técnica de electroporação. Este vídeo demonstra alvejado injecção da retina e em eletroporação in ovo dentro da retina de pinto embrionário no Hamburger e do estágio Hamilton 22-23, o que é de cerca de dia embrionário 4 (E4). Aqui nós mostramos uma rápida e conveniente em técnica de eletroporação in ovo através do qual um DNA de plasmídeo que expressa a proteína fluorescente verde (GFP) como um marcador está diretamente entregue napinto espaço sub-retiniano embrionário e seguido por pulsos elétricos para facilitar a absorção de DNA por retina estaminais / progenitoras das células. O novo método de injecção de retina e electroporação em E4 permite a visualização de todos os tipos celulares da retina, incluindo a neurônios tardia-nascido 1, que tem sido difícil com o método convencional da injecção e electroporação em E1.5 2.
Protocol
Uma vez que algumas partes do protocolo são realizados conforme descrito anteriormente em outros vídeos Jové 2 e papéis 3 com modificações menores não vamos discutir aqueles em detalhe aqui. 1. Manuseio de ovo e Preparação Agulha Os ovos podem ser armazenados em um refrigerador de vinho menos cerca de 13 ° C por até 1 semana. Se a temperatura é demasiado elevada, os embriões vai começar a desenvolver de forma anormal, enquanto que, baixa tempera…
Discussion
Targeted injecção da retina e em eletroporação in ovo em retina embrionária no estádio de E4 podem objetivar especificamente as células progenitoras da retina, resultando em a habilidade de visualizar todos os seis principais tipos de células da retina no nível da célula única. Em electroporação in ovo em HH10 (~ E1.5) alvejando o vesícula óptica é capaz de transfectar células que se desenvolvem para formar o olho. No entanto, estas células têm um volume de negócio…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer ao Sr. Maaz Enver para o uso de sua câmera HD (Cannon VIXIA HFS100). Este trabalho foi apoiado em parte por concessões do NIH (EY018738), Nova Jersey, Comissão de Pesquisa da Medula Espinhal (08-3074-SCR-E-0 e 10-3091-SCR-E-0), e Prêmio de Pesquisa Biomédica Busch.
Materials
Name of the reagent
Company
Catalogue number
Comments
Fertilized pathogen-free (SPF) white leghorn chicken eggs
Sunrise Farms (Catskill, NY)
Chicken egg incubator
GQF manufacturing, Savannah, GA
Model-1550
Set to 60% humidity and 37.5°C.
Glass capillary tubes
World Precision Instrument Inc.
TW150F-4
0.1 ml syringe
Hamilton Co. Reno, Nevada
Gastight 1710
Alternatively 1ml syringe can be used as well
Masterflex Silicone (peroxide) Tubing
Cole-Parmer
HV-96400-13
Cut a small piece (1 cm) for attaching the glass needle to the syringe