En electroporación in ovo en la retina de embriones de pollo
Summary
El objetivo general de este video es mostrar cómo llevar a cabo la inyección específica de retina y<em> In ovo</em> Electroporación de ADN / ARN construcciones en la retina de embriones de pollo en el Hamburger y la etapa de Hamilton 22-23, que es aproximadamente el día embrionario 4 (E4). Esta técnica es muy útil para estudiar la expresión génica, la regulación de genes, y el cambio morfológico en el desarrollo de retina de pollo.
Abstract
La retina embrionaria de pollo es una excelente herramienta para estudiar el desarrollo de la retina en los vertebrados superiores. Debido al enorme tamaño y desarrollo externo, es comparativamente muy fácil de manipular la retina de embriones de pollo con ADN recombinante / tecnología de ARN. La electroporación de ADN / ARN construcciones dentro de la retina embrionaria tienen una gran ventaja para estudiar la regulación de genes en la retina células madre / progenitoras durante el desarrollo de la retina. Diferentes tipos de ensayos tales como la prueba del gen, la sobre-expresión del gen, el gen tumbar (shRNA), etc se puede realizar utilizando la técnica de electroporación. Este video muestra la inyección dirigida la retina y en la electroporación in ovo en la retina de embriones de pollo en el Hamburger y Hamilton etapa de 22-23, que es aproximadamente el día embrionario 4 (E4). Aquí nos muestran un rápido y conveniente en la técnica de electroporación in ovo por el cual un plásmido de ADN que expresa la proteína verde fluorescente (GFP) como marcador se entregarán directamente en elde embriones de pollo subretiniano espacio y seguido por pulsos eléctricos para facilitar la absorción de ADN por la retina células madre / progenitoras. El nuevo método de inyección de retina y la electroporación en E4 permite la visualización de todos los tipos de células retinales, incluyendo la neuronas tarde-nacido en 1, que ha sido difícil con el método convencional de inyección y la electroporación en E1.5 2.
Protocol
Discussion
Dirigida por inyección en la retina y la electroporación in ovo en la retina de embrión en la etapa E4 pueden dirigirse específicamente a las células retinianas progenitoras derivadas de la capacidad de visualizar todos los seis tipos principales de células de retina en el nivel de células individuales. En la electroporación in ovo en HH10 (~ E1.5) centradas en la vesícula óptica es capaz de transfectar células que se desarrollan para formar el ojo. Sin embargo, estas célu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría dar las gracias al Sr. Enver Maaz para el uso de su cámara de alta definición (Cannon VIXIA HFS100). Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones de NIH (EY018738), Nueva Jersey Comisión de Investigación de la Médula Espinal (08-3074-SCR-E-0 y 10-3091-SCR-0-E), y Busch Premio de Investigación Biomédica.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Fertilized pathogen-free (SPF) white leghorn chicken eggs | Sunrise Farms (Catskill, NY) | ||
| Chicken egg incubator | GQF manufacturing, Savannah, GA | Model-1550 | Set to 60% humidity and 37.5°C. |
| Glass capillary tubes | World Precision Instrument Inc. | TW150F-4 | |
| 0.1 ml syringe | Hamilton Co. Reno, Nevada | Gastight 1710 | Alternatively 1ml syringe can be used as well |
| Masterflex Silicone (peroxide) Tubing | Cole-Parmer | HV-96400-13 | Cut a small piece (1 cm) for attaching the glass needle to the syringe |
| Tweezers | Dumont | AA | |
| Micromanipulator | World Precision Instrument Inc. | M3301-M3 | |
| Plasmid DNA | pCAG-GFP was borrowed from Dr. Connie Cepko | ||
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252 | Dilute it to 0.025 % with PBS |
| Pulse generator | Harvard Apparatus, MA | BTX ECM 830 | Square wave generator |
| Electrodes | Harvard Apparatus, MA | BTX model 514 | Our electrodes were spaced 3-5 mm apart |
| Monochrome Digital Camera | Zeiss, Germany | Axiocam MRM | |
| Fluorescent Dissection Microscope | Leica Microsystems, Germany | Leica MZ16FA | |
| Upright Fluorescence Microscope | Zeiss, Germany | Zeiss Axio Imager A1 |
References
- Doh, S. T. Analysis of retinal cell development in chick embryo by immunohistochemistry and in ovo electroporation techniques. BMC. Dev. Biol. 10, (2010).
- Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos. J. Vis. Exp. (9), e408-e408 (2007).
- Nakamura, H., Funahashi, J. Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation. Methods. 24, 43-48 (2001).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Dev. Dyn.. 195, 231-272 (1992).
- Hamburger, V. The stage series of the chick embryo. Dev. Dyn. 195, 273-275 (1992).
