I Ovo Elektroporation i embryonal Chick Retina

Summary

Det övergripande målet för den här videon är att visa hur man utför riktade retinal injektion och<em> I ovo</em> Elektroporation av DNA / RNA-konstruktioner i ungen embryonala näthinnan på Hamburger och Hamilton steg 22-23, som handlar om embryonala Dag 4 (E4). Denna teknik är mycket användbar för att studera genuttryck, genreglering och morfologiska förändringar i utvecklingen av chick näthinnan.

Abstract

Kyckling embryonal näthinnan är ett utmärkt verktyg för att studera retinal utveckling i högre ryggradsdjur. På grund av storlek och extern utveckling, är det jämförelsevis mycket enkelt att manipulera ungen embryonala näthinnan med hjälp av rekombinant DNA / RNA-teknik. Elektroporering av DNA / RNA-konstruktioner i embryonala näthinnan har en stor fördel att studera genreglering i retinala stamceller / progenitorceller under retinal utveckling. Annorlunda typ av analyser såsom reportergen-analysen, gen över-uttryck,-genen knock ned (shRNA) etc kan utföras med användning den elektroporering tekniken. Denna video demonstrerar riktade retinal injektion och ovo elektroporation i embryonala kycklingen näthinnan på Hamburger och Hamilton steg 22-23, som handlar om embryonala Dag 4 (E4). Här visar vi en snabba och bekväma att in ovo-elektroporation teknik varigenom en plasmid-DNA som uttrycker grönt fluorescerande protein (GFP) i form av en markör levereras HlVl direkt in i denbrud embryonisk subretinala utrymmet och följt av elektriska pulser för att underlätta DNA-upptag genom att retinala stam / progenitorceller. Den nya metod för retinal injektion och elektroporering vid E4: an tillåter den visualisering av alla retinala celltyper, inklusive den sena-födda neuroner ^1, vilket har varit svårt med den konventionella metoden för injektion och elektroporering vid E1.5 ^2.

Protocol

Eftersom vissa delar av protokollet utförs som tidigare beskrivits i andra Jové videor 2 och papper 3 med mindre modifiering vi inte kommer att diskutera dem i detalj här. 1. Ägg Hantering och nål Förberedelse Ägg kan lagras i ett vin svalare vid omkring 13 ° C under upp till 1 vecka. Om temperaturen är för hög, kommer embryon börja utveckla onormalt, medan lägre temperaturer orsakar hög dödlighet. När du är redo att inkubera ta ut ägg från…

Discussion

Riktade retinal injektion och ovo elektroporation i embryonal näthinnan i E4 skede kan specifikt rikta retinala stamceller resulterar i förmågan att visualisera alla sex huvudtyper näthinnan cell på en enda cell nivå. Ovo elektroporering vid HH10 (~ E1.5) riktade till optiken vesikel är i stånd att transfektera celler som utvecklas för att bilda den ögat. Emellertid, dessa celler har en väldigt hög omsättning vid denna tid och denna metod är inte specifik för retinala celler. Det kan var…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
Fertilized pathogen-free (SPF) white leghorn chicken eggs	Sunrise Farms (Catskill, NY)
Chicken egg incubator	GQF manufacturing, Savannah, GA	Model-1550	Set to 60% humidity and 37.5°C.
Glass capillary tubes	World Precision Instrument Inc.	TW150F-4
0.1 ml syringe	Hamilton Co. Reno, Nevada	Gastight 1710	Alternatively 1ml syringe can be used as well
Masterflex Silicone (peroxide) Tubing	Cole-Parmer	HV-96400-13	Cut a small piece (1 cm) for attaching the glass needle to the syringe
Tweezers	Dumont	AA
Micromanipulator	World Precision Instrument Inc.	M3301-M3
Plasmid DNA			pCAG-GFP was borrowed from Dr. Connie Cepko
Fast Green FCF	Sigma-Aldrich	F7252	Dilute it to 0.025 % with PBS
Pulse generator	Harvard Apparatus, MA	BTX ECM 830	Square wave generator
Electrodes	Harvard Apparatus, MA	BTX model 514	Our electrodes were spaced 3-5 mm apart
Monochrome Digital Camera	Zeiss, Germany	Axiocam MRM
Fluorescent Dissection Microscope	Leica Microsystems, Germany	Leica MZ16FA
Upright Fluorescence Microscope	Zeiss, Germany	Zeiss Axio Imager A1