Single Cell Meting van dopamine-afgifte met gelijktijdige Voltage-klem en amperometrie
Summary
De amperometrische techniek meet dopamine afgifte van een enkele cel door het detecteren van de stroom die door oxidatieve spontane dopamine oxidatie. Gelijktijdig spanning klem en amperometrie methodologie onthullen de mechanistische relatie tussen de totale "activiteit" van dopamine transporter en de regulerende rol van deze activiteit op de achterzijde transport van dopamine.
Abstract
Na de introductie in de synaptische spleet, dopamine oefent zijn biologische eigenschappen via de pre-en post-synaptische doelstellingen 1. De dopamine signaal wordt beëindigd door diffusie 2-3, extracellulaire enzymen 4 en membraan transporters 5. De dopamine transporter, gelegen in het peri-synaptische spleet van dopamine neuronen wist de vrijgekomen aminen door middel van een naar binnen dopamine flux (opname). De dopamine transporter kan ook in omgekeerde richting om aminen vrijgeven van binnen naar buiten in een proces genaamd naar buiten vervoer of efflux van dopamine 5. . Meer dan 20 jaar geleden Sulzer et al. rapporteerden de dopamine transporter kan in twee vormen van activiteit: vooruit (opname) en achteruit (efflux) 5. De neurotransmitter model via efflux door de transporter kunt een grote hoeveelheid dopamine naar de extracellulaire ruimte, en blijkt een belangrijke regulerende rol spelen in extracellulaire dopamine homeostasis 6. Hier beschrijven we hoe gelijktijdige patch clamp en amperometrie registratie kan worden toegepast om model dopamine meten via de efflux mechanisme milliseconde tijdsresolutie wanneer de membraanpotentiaal wordt geregeld. Hiervoor zijn gehele celstroom en oxidatieve (amperometrische) signalen gelijktijdig gemeten met een Axopatch 200B versterker (Molecular Devices, een low-pass filter set Bessel bij 1000 Hz voor whole-cell huidige opname). Voor amperometrie opnemen van een koolstofvezel elektrode is verbonden met een tweede versterker (Axopatch 200B) en grenzend aan het plasmamembraan en +700 mV gehouden. De volledige cel en oxidatieve (amperometrische) stromen kunnen worden opgenomen en de stroom-spanning relatie kan worden gegenereerd met een spanningssprong protocol. In tegenstelling tot de gebruikelijke amperometrische kalibratie, die omzetting concentratie is vereist, wordt de stroom direct gerapporteerd zonder de effectieve volume 7. Aldus de verkregen datavertegenwoordigen een ondergrens aan dopamine efflux omdat sommige zender wordt verloren aan de bulk oplossing.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gelijktijdige voltage-clamp en amperometrie heeft de volgende voordelen. Alle celtypen zijn toegankelijk en kunnen worden gebruikt voor opname. De identificatie van de cellen of neuron waar de opnames worden gedaan, is eenvoudig en ongecompliceerd. Met name wanneer de cel fluorescent gelabelde door toevoeging van een fluorescerend label aan het eiwit van belang de experimentator kan eenvoudig de doelcel of neuron. De experimentele configuratie maakt uniforme en gecontroleerde afgifte van farmacologische middelen hetzij …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Dr Sanika Chirwa voor kritische beoordeling van dit manuscript. Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health (DA026947, DA021471, en NS071122).
Materials
| Equipment | |||
| Anti-vibration table w/faraday cage | Technical Manufacturing Corporation | 63-500 series | we use model 63-543 |
| Inverted microscope Nikon TE-2000 | Nikon | discontinued | now Eclipse Ti |
| Two low noise amplifiers axopatch 200b | Molecular Devices | 800-635-5577 | |
| 1-CV 203 BU headstage | Molecular Devices | 800-635-5578 | |
| 1-HL-U pipette holder | Molecular Devices | 800-635-5579 | |
| Digidata 1440A A/D converter | Molecular Devices | 800-635-5580 | |
| Two manipulators Siskyou, left and right handed | Siskiyou | MX6600R MX6600L | 877-313-6418 |
| Laser pipette puller | Sutter Instruments | P-2000 | 888-883-0128 |
| Low noise carbon fiber amperometric electrode | ProCFE | www.dagan.com | |
| Low noise quartz pipette | Sutter Instruments | QF100-70-7.5 | 888-883-0128 |
| 12-volt car battery | widely available | ||
| Car battery charger | widely available | ||
| Reagent | |||
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S7653 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Dextrose | Sigma | G7528 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma | M2643 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma | P5655 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P9333 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2•2H20) | Sigma | 223506 | |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2•6H20) | Sigma | M2670 | |
| EGTA | Sigma | E0396 |
References
- Michael, A. C., Ikeda, M., Justice, J. B. Mechanisms contributing to the recovery of striatal releasable dopamine following MFB stimulation. Brain Res. 421, 325-335 (1987).
- Gonon, F. Prolonged and extrasynaptic excitatory action of dopamine mediated by D1 receptors in the rat striatum in vivo. J. Neurosci. 17, 5972-5978 (1997).
- Sulzer, D., Pothos, E. N. Regulation of quantal size by presynaptic mechanisms. Rev. Neurosci. 11, 159-212 (2000).
- Napolitano, A., Cesura, A. M., Da Prada, M. The role of monoamine oxidase and catechol O-methyltransferase in dopaminergic neurotransmission. J. Neural. Transm. Suppl. 45, 35-45 (1995).
- Sulzer, D., Maidment, N. T., Rayport, S. Amphetamine and other weak bases act to promote reverse transport of dopamine in ventral midbrain neurons. J. Neurochem. 60, 527-535 (1993).
- Salahpour, A., et al. Increased amphetamine-induced hyperactivity and reward in mice overexpressing the dopamine transporter. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 4405-4410 (2008).
- Khoshbouei, H., Wang, H., Lechleiter, J. D., Javitch, J. A., Galli, A. Amphetamine-induced dopamine efflux. A voltage-sensitive and intracellular Na+-dependent mechanism. J. Biol. Chem. 278, 12070-12077 (2003).
- Goodwin, J. S., et al. Amphetamine and methamphetamine differentially affect dopamine transporters in vitro and in. , 284-2978 (2009).
- Kahlig, K. M., et al. Amphetamine induces dopamine efflux through a dopamine transporter channel. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 3495-3500 (2005).
- Swant, J., Chirwa, S., Stanwood, G., Khoshbouei, H. Methamphetamine reduces LTP and increases baseline synaptic transmission in the CA1 region of mouse hippocampus. PLoS One. 5, e11382 (2010).
- Gnegy, M. E., et al. Intracellular Ca2+ regulates amphetamine-induced dopamine efflux and currents mediated by the human dopamine transporter. Mol. Pharmacol. 66, 137-143 (2004).
