شاشة الوراثية لعزل التوكسوبلازما جوندياي المسوخ الخروج المضيف الخلية

Summary

تقدم علم الوراثة هو وسيلة قوية لكشف المستوى الجزيئي لكيفية<em> التوكسوبلازما</em> المخارج من الخلية المضيفة لها. وتقدم بروتوكولات mutagenize كيميائيا الطفيليات، وإثراء لالمسوخ مع العيوب التي يسببها في الخروج، والتحقق من صحة النمط الظاهري من المسوخ المستنسخة.

Abstract

، وتلزم على نطاق واسع داخل الخلايا، طفيل بروتوزوا المقوسة الغوندية يسبب مرض الانتهازية في المناعية للخطر المرضى ويسبب تشوهات خلقية على العدوى الخلقية. وتتميز دورة النسخ المتماثل التحللي من ثلاث مراحل: 1. نشط غزو خلية المضيفة الأنوية، 2. تكرار داخل الخلية المضيفة، 3. نشط الخروج من الخلية المضيفة. وعلى نحو متزايد آلية الخروج يجري تقديره بوصفه عملية فريدة من نوعها، تنظيما، والتي لا تزال غير مفهومة على المستوى الجزيئي. وقد اتسمت مسارات الإشارات الكامنة وراء الخروج من خلال استخدام وكلاء الدوائية تعمل على جوانب مختلفة من مسارات ^1-5. على هذا النحو، وقد تم تحديد عدة مشغلات مستقلة من الخروج التي تتلاقى كل على اطلاق سراح الكالسيوم داخل الخلايا ^{2 +،} إشارة إلى أن من المهم أيضا للغزو الخلية المضيفة ^6-8. وأبلغت هذه الرؤية نهج الجين مرشح الذي أدى إلى identiتقويتها من النباتات مثل الكالسيوم بروتين كيناز تعتمد (CDPK) تشارك في الخروج ^9. وبالإضافة إلى ذلك، تم تحقيق اختراقات عديدة مؤخرا في الخروج التفاهم باستخدام (مادة كيميائية) النهج الوراثية ^10-12. من الجمع بين وفرة المعلومات الدوائية مع إمكانية الوصول الوراثية المتزايدة للالتوكسوبلازما أنشأنا مؤخرا على شاشة السماح لتخصيب اليورانيوم لالمسوخ طفيلي مع وجود خلل في خروج الخلية المضيفة ^13. على الرغم من استخدام الطفرات الكيميائية باستخدام N-إيثيل-N-nitrosourea (ENU) أو إيثيل methanesulfonate (EMS) لعقود من الزمان في دراسة علم الأحياء التوكسوبلازما ^11،14،15، إلا في الآونة الأخيرة ورسم الخرائط الوراثية من الطفرات الكامنة وراء الظواهر تصبح روتينية ^{16 -18.} وعلاوة على ذلك، من خلال توليد الحرارة حساسة المسوخ، يمكن تشريح العمليات الأساسية والجينات الكامنة التي تم تحديدها مباشرة. هذه المسوخ تتصرف كما نوع البرية تحت درجة حرارة متساهلة (35 درجة مئوية)، لكنه يفشل في فroliferate في درجة الحرارة تقييدا ​​(40 درجة مئوية) وذلك نتيجة للطفرة في السؤال. نحن هنا لتوضيح طريقة جديدة لعزل الفحص المظهري المسوخ مع النمط الظاهري الخروج حساسة للحرارة ^13. والتحدي الذي يواجه شاشات الخروج هو الفصل egressed من غير egressed طفيليات، وهي مسألة معقدة بسبب بسرعة إعادة غزو والحساسية العامة للطفيليات إلى الخلايا المضيفة. واستند شاشة الخروج المحددة سابقا على سلسلة معقدة من الخطوات للفصل بين الخلايا biotinylation من طفيليات خارج الخلية ^11. هذا الأسلوب أيضا لم تولد المسوخ الشرطي مما أدى إلى ضعف الظواهر. الطريقة الموضحة هنا يتغلب على تعلقه الشديد من egressing الطفيليات بما في ذلك من قبل منافس غليكان، كبريتات ديكستران (DS)، الذي يمنع الطفيليات من الالتصاق إلى الخلية المضيفة ^19. وعلاوة على ذلك، يتعرضون للقتل على وجه التحديد طفيليات خارج الخلية قبالة عن طريق dithiocarbamate بيروليدين (PDTC)، الذي يترك الطفيليات داخل الخلايادون أن يصاب بأذى ^20. لذلك، مع شاشة المظهري جديدة لعزل تحديدا المسوخ طفيلي مع عيوب في الخروج الناجم، ويمكن الآن قوة علم الوراثة يمكن نشرها بالكامل لكشف الآليات الجزيئية الكامنة وراء خروج الخلية المضيفة.

Protocol

نظرة عامة وتقدم البروتوكولات لتحديد أول جرعة من المغير مما أدى إلى مقتل 70٪ من الطفيليات (بروتوكول 1). ويرد الإجراء التالي لإثراء المسوخ الخروج الناجم عن طفيلي من تجمع mutagenized (بروتوكول 2، الشكل 2). ويعقب ذلك وضع بروتوكول لاختبار حدوث ط?…

Discussion

بروتوكول وصف يوفر وسيلة فعالة لعزل المسوخ التوكسوبلازما مع عيب الخروج. لقد نجحنا في عزل المسوخ على طول خطوات مختلفة لمسار الخروج، وبعضها لديها النمط الظاهري غزو المزدوج ^13. ويمكن تحديد الآثار المحتملة على الغزو باستخدام ما يسمى الأحمر والأخضر الفحص، ال…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
ENU	Sigma-Aldrich	N3385	1 M Stock in DMSO, store at -20°C
EMS	Sigma-Aldrich	M0880	1 M Stock in DMSO, store at -20°C
Dextran Sulfate	Sigma-Aldrich	D4911
PDTC	Sigma-Aldrich	P8765	100 mM Stock in PBS
Diff Quick	EMD Chemicals	65044-93
Filter holder	Cole-Parmer	540100
3 μm polycarbonate filter	Whatman Schleicher & Schuell	110612
Hemocytometer	Hausser Scientific	1475
CO2 incubators	Various manufacturers		Humidified, 5% CO2, at 35, 37 and 40°C
Fluorescence microscope	Various manufacturers		Ideally inverted, wide-field with 63x or 100x oil objective

HBSSc (according to Black et al.¹¹):

• 98.0 ml Hanks Balanced Salt Solution (Hyclone catalog number SH30588)
• 100 μl 1M MgCl₂ (100 mM end)
• 100 μl 1M CaCl₂ (100 mM end)
• 2.0 ml 1M Hepes pH 7.3 (20 mM end)
• 84 mg NaHCO₃ (10 mM end)