Un crible génétique pour isoler Toxoplasma gondii Mutants Egress de la cellule hôte

Summary

Transférer la génétique est une méthode puissante pour percer au niveau moléculaire de la façon dont<em> Toxoplasma</em> Egresses de sa cellule hôte. Les protocoles sont fournis à chimiquement mutagénéiser parasites, d'enrichir de mutants présentant des défauts dans l'évacuation induite, et de valider le phénotype des mutants clonés.

Abstract

Le répandue, intracellulaire obligatoire, parasite protozoaire Toxoplasma gondii qui cause la maladie opportuniste dans les patients immunodéprimés et provoque des malformations congénitales lors de l'infection congénitale. Le cycle de réplication lytique est caractérisée par trois étapes: 1. invasion active d'une cellule hôte nucléé; 2. réplication dans la cellule hôte; 3. évacuation connexion de la cellule hôte. Le mécanisme de sortie est de plus en plus apprécié comme un processus unique et très réglementé, qui est encore mal comprise au niveau moléculaire. Les voies de signalisation qui sous-tendent l'évacuation ont été caractérisées par l'utilisation d'agents pharmacologiques agissant sur ​​les différents aspects des voies ^1-5. En tant que tel, plusieurs déclencheurs indépendants d'évacuation ont été identifiées qui convergent toutes sur la libération de Ca ^{2 +} intracellulaire, un signal qui est également critique pour l'invasion des cellules d'accueil ^6-8. Cette idée a informé une approche gène candidat qui a conduit à l'identificationfication de la plante comme la protéine kinase dépendante du calcium (CDPK) impliqués dans l'évacuation ^9. En outre, quelques avancées récentes dans la compréhension de sortie ont été réalisés en utilisant (chimique) des approches génétiques ^10-12. Pour combiner la richesse de l'information pharmacologique de l'accessibilité croissante génétique de Toxoplasma nous avons récemment créé un écran permettant l'enrichissement de mutants du parasite avec un défaut de sortie cellule hôte ^13. Bien que la mutagenèse chimique utilisant le N-éthyl-N-nitroso-urée (ENU) ou le méthanesulfonate d'éthyle (EMS) a été utilisé pendant des décennies dans l'étude de la biologie Toxoplasma ^11,14,15, n'est que récemment que la cartographie génétique des mutations qui sous-tendent les phénotypes devenu une routine ^{16 -18.} En outre, en générant des mutants sensibles à la température, les processus essentiels peuvent être disséqués et les gènes sous-jacents directement identifié. Ces mutants se comporter comme de type sauvage en vertu de la température permissive (35 ° C), mais ne parviennent pas à proliferate à la température restrictive (40 ° C) en tant que résultat de la mutation en question. Ici, nous illustrer une nouvelle méthode de criblage phénotypique à isoler des mutants avec un phénotype sensible à la température de sortie ^13. Le défi pour les écrans d'évacuation est de séparer est sorti de non-évacué parasites, qui est compliqué par la ré-invasion rapide et collant générale des parasites aux cellules hôtes. Un écran de sortie a été précédemment établi sur la base d'une série d'étapes lourdes biotinylation de séparer intracellulaire de parasites extracellulaires ^11. Cette méthode n'a pas non plus générer des mutants conditionnels résultant de phénotypes faibles. La méthode décrite ici surmonte le fort attachement de egressing parasites en incluant un concurrent glycane, le sulfate de dextrane (DS), qui empêche les parasites de coller à la cellule ¹⁹ hôte. En outre, les parasites extracellulaires sont spécifiquement tué par la pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC), ce qui laisse des parasites intracellulairessains et saufs ^20. Par conséquent, avec un nouvel écran phénotypique spécifiquement isoler des mutants de parasites avec les défauts de sortie induite, la puissance de la génétique peuvent désormais être pleinement déployé à élucider les mécanismes moléculaires qui sous-tendent l'évacuation cellule hôte.

Protocol

Vue d'ensemble Les protocoles sont fournis à d'abord définir le dosage de l'agent mutagène menant à un meurtre de 70% des parasites (protocole 1). La procédure suivante est prévue pour enrichir les mutants induits évacuation d'un bassin mutagénisé parasite (protocole n ° 2, figure 2). Cette opération est suivie par un protocole pour tester l'incidence de mutants d'évacuation dans la piscine enrichi, ou pour valider le phénotype de sortie dans des mutants ind…

Discussion

Le protocole décrit fournit une méthode efficace pour isoler des mutants de Toxoplasma avec un défaut de sortie. Nous avons réussi à isoler des mutants ainsi que différentes étapes de la voie de sortie, dont certains ont un phénotype invasion double ^13. Les effets potentiels sur l'invasion peut être déterminé en utilisant la soi-disant test rouge-vert, ce qui différencie envahi de non-envahis par des parasites coloration des anticorps différentiel ^23,24. Pour les tes…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
ENU	Sigma-Aldrich	N3385	1 M Stock in DMSO, store at -20°C
EMS	Sigma-Aldrich	M0880	1 M Stock in DMSO, store at -20°C
Dextran Sulfate	Sigma-Aldrich	D4911
PDTC	Sigma-Aldrich	P8765	100 mM Stock in PBS
Diff Quick	EMD Chemicals	65044-93
Filter holder	Cole-Parmer	540100
3 μm polycarbonate filter	Whatman Schleicher & Schuell	110612
Hemocytometer	Hausser Scientific	1475
CO2 incubators	Various manufacturers		Humidified, 5% CO2, at 35, 37 and 40°C
Fluorescence microscope	Various manufacturers		Ideally inverted, wide-field with 63x or 100x oil objective

HBSSc (according to Black et al.¹¹):

• 98.0 ml Hanks Balanced Salt Solution (Hyclone catalog number SH30588)
• 100 μl 1M MgCl₂ (100 mM end)
• 100 μl 1M CaCl₂ (100 mM end)
• 2.0 ml 1M Hepes pH 7.3 (20 mM end)
• 84 mg NaHCO₃ (10 mM end)