Summary

Crescita Mycobacterium tuberculosis I biofilm

Published: February 15, 2012
doi:

Summary

Mycobacterium tuberculosis forma biofilm droga tolleranti, quando coltivate in determinate condizioni. Qui si descrivono i metodi per la coltura M. biofilm tubercolosi e che determinano la frequenza di persistenti droga tolleranti. Questi protocolli saranno utili per ulteriori studi sui meccanismi di tolleranza al farmaco in M. tubercolosi.

Abstract

Mycobacterium tuberculosis, l'agente eziologico della tubercolosi umana, ha una straordinaria capacità di sopravvivere contro gli stress ambientali, compresi gli antibiotici. Sebbene la tolleranza allo stress di M. la tubercolosi è uno dei contributori probabili a 6 mesi di chemioterapia lunga serie di tubercolosi 1, i meccanismi molecolari alla base di questo fenotipo caratteristico del patogeno rimangono poco chiari. Molte specie microbiche sono evoluti per sopravvivere in ambienti stressanti con l'auto-assemblaggio in altamente organizzato, superficie attaccata, e matrice di strutture incapsulate chiamata biofilm 2-4. La crescita nelle comunità sembra essere una strategia di sopravvivenza preferito di microbi, e si ottiene attraverso componenti genetiche che regolano la superficie di applicazione, le comunicazioni intercellulari, e la sintesi di sostanze polimeriche extracellulari (EPS) 5,6. La tolleranza allo stress ambientale è probabilmente facilitata da EPS, e forse dal fisiologicoadattamento gico di bacilli individuale microambienti eterogenei all'interno della complessa architettura dei biofilm 7.

In una serie di lavori recenti abbiamo stabilito che M. smegmatis Mycobacterium tuberculosis e hanno una forte propensione a crescere in strutture organizzate pluricellulari, chiamata biofilm, che può tollerare più di 50 volte le concentrazioni minime inibenti dei farmaci antitubercolari isoniazide e rifampicina 8-10. M. la tubercolosi, però, richiede intrigante condizioni specifiche per formare biofilm maturi, in particolare il rapporto di 9:01: spazio di testa dei media così come limitato scambio d'aria con l'atmosfera 9. Requisiti di specializzati condizioni ambientali potrebbe essere legato al fatto che M. la tubercolosi è un patogeno obbligato umana e quindi si è adattata agli ambienti dei tessuti. In questa pubblicazione si dimostra metodi di coltura M. tubercolosibiofilm in una bottiglia e un 12-pozzetti piastra, che è conveniente per studi batteriologici nonché genetica. Abbiamo descritto il protocollo per un ceppo attenuato di M. la tubercolosi, mc 2 7000, con l'eliminazione nei due loci, i panCD e RD1, che sono fondamentali per la crescita del patogeno vivo 9. Questo ceppo può essere tranquillamente utilizzato in un BSL-2 di contenimento per la comprensione della biologia di base del patogeno della tubercolosi evitando così l'esigenza di un costoso impianto di BSL-3. Il metodo può essere esteso, con le opportune modifiche in media, a crescere biofilm di altre specie coltivabili micobatteri.

Nel complesso, un protocollo uniforme di biofilm coltura dei micobatteri aiuterà i ricercatori interessati a studiare le caratteristiche di base di micobatteri resistenti. Inoltre, un metodo chiaro e conciso di biofilm che crescono micobatteriche aiuterà anche i inv clinico e farmaceuticoestigators per testare l'efficacia di un potenziale farmaco.

Protocol

1. Biofilm crescente di M. tubercolosi in una bottiglia con tappo a vite 250mL Preparazione Media: sciogliere 0,5 g di KH 2 PO 4, 0,5 g di MgSO 4, 4 g di L-asparagina, 2 g di acido citrico, 0,05 g di citrato ferrico di ammonio, 60 ml di glicerolo in 900 ml di acqua. Regolare il pH a 7,0 con NaOH. Autoclave, fresco e appena prima di iniziare l'esperimento, ZnSO 4 aggiungere sterile ad una concentrazione finale di 0,1% w / v Dal 7000 mc 2</…

Discussion

La tubercolosi (TB), causata da l'infezione di Mycobacterium tuberculosis, rimane una grave minaccia per la salute pubblica globale. Quasi un terzo della popolazione mondiale è stimata essere asintomatica infettati dal patogeno, circa 9 milioni di nuovi casi appaiono in clinica ogni anno con sintomi di TB attiva e circa 1,7 milioni muoiono di infezione ogni anno 11. L'enorme peso della malattia è principalmente contribuito la mancanza di un vaccino e di una chemioterapia altamente complessa…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Il lavoro è stato realizzato con il sostegno finanziario del National Institute of Health e la American Lung Association.

Materials

Equipment and supplies SUPPLIER CATALOG NUMBER
Incubator VWR Model # 1923/25
Polystyrene culture bottles Fisher Scientific 03-374-300
12-well tissue culture plate VWR 62406-165
50-mL conical tubes VWR 89039-660
Rocker Thermo Scientific 57019-662
Chromatographic refrigerator VWR 55702-520
petri dish VWR 25384-342
     
REAGENT SUPPLIER CATALOG NUMBER
KH2PO4 (monobasic) EMD PX1565-1
MgSO4 Fisher M65-500
L-asparagine Sigma A4284-100G
citric acid Sigma C1857-100G
ferric ammonium citrate Sigma F5879-100G
glycerol EMD GX0185-5
NaOH Sigma S8045-500G
ZnSO4 Sigma Z4750-500G
D-pantothenic acid Sigma P2250-25G
Difco Middlebrook 7H9 Broth Becton Dickinson 271310
Middlebrook OADC Enrichment BBL 212351
Tween-80 Fisher T164-500
250mL storage bottle Corning 430281
12 well plates Falcon (BD) 353043
rifampicin Sigma R3501-1G
methanol J.T. Baker 9070-05
10mlLsyringe Becton Dickinson 301604
1-200μL pipet tips VWR 89079-458
parafilm M VWR PM-996
15mL centrifuge tube Greiner Bio-One 188-285
Difco Mycobacteria 7H11 Agar Becton Dickinson 283810
NaCl Fisher BP358-1
KCl Sigma P9333-500G
Na2HPO4 (dibasic) Sigma S0876-500G

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Cite This Article
Kulka, K., Hatfull, G., Ojha, A. K. Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms. J. Vis. Exp. (60), e3820, doi:10.3791/3820 (2012).

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