Wachstum von Mycobacterium tuberculosis Biofilme

Summary

Mycobacterium tuberculosis bildet Wirkstoff toleranten Biofilme, wenn unter bestimmten Bedingungen kultiviert. Hier beschreiben wir Verfahren zur Kultivierung von M. Tuberkulose Biofilmen und die Bestimmung der Häufigkeit des Drogenkonsums tolerant persisters. Diese Protokolle werden für weitere Studien sinnvoll in die Mechanismen der Verträglichkeit der Medikamente in M. Tuberkulose.

Abstract

Mycobacterium tuberculosis, dem Erreger der menschlichen Tuberkulose, hat eine außerordentliche Fähigkeit, gegen Umweltbelastungen einschließlich Antibiotika überleben. Obwohl Stresstoleranz von M. Tuberkulose ist eine der wahrscheinlich Mitwirkenden an den 6-monatigen Chemotherapie der Tuberkulose ^ein, bleiben die molekularen Mechanismen dieser charakteristischen Phänotyp des Erregers unklar. Viele mikrobielle Spezies entwickelt haben, um in stark beanspruchenden Umgebungen von sich selbst organisierenden überleben in hoch organisierten, Oberfläche angebracht und Matrix eingekapselt Strukturen, so genannte Biofilme ^2-4. Das Wachstum in den Gemeinden scheint eine bevorzugte Überlebensstrategie von Mikroben sein, und wird durch genetische Komponenten, die Oberfläche Befestigung, interzelluläre Kommunikation, und die Synthese von extrazellulären polymeren Substanzen (EPS) ^5,6 Regulierung erreicht. Die Toleranz gegenüber widrigen Umweltbedingungen wird wahrscheinlich durch EPS erleichtert, und vielleicht durch die physiogische Anpassung einzelner Bazillen auf heterogene Mikroumgebung innerhalb der komplexen Architektur von Biofilmen ^7.

In einer Reihe von neueren Arbeiten haben wir festgestellt, dass M. tuberculosis und Mycobacterium smegmatis haben eine starke Neigung, in organisierten vielzelligen Strukturen wachsen genannten Biofilmen, die vertragen mehr als 50 Mal können die minimalen Hemmkonzentrationen der Anti-Tuberkulose-Medikamente Isoniazid und Rifampicin ^10.08. M. Tuberkulose, aber faszinierend erfordert spezielle Bedingungen, um reife Biofilme, insbesondere 9:1-Verhältnis von Headspace bilden: Medien sowie eingeschränkte Luftaustausch mit der Atmosphäre ^9. Bedarf an spezialisierten Umweltbedingungen könnte möglicherweise auf die Tatsache, dass M. verknüpft werden Tuberkulose ist ein obligat humanpathogene und damit hat sich um Gewebe-Umgebungen angepasst. In dieser Veröffentlichung zeigen wir Methoden zur Kultivierung von M. TuberkuloseBiofilme in einer Flasche und einer 12-Well-Platte-Format, die bequem für bakteriologische sowie genetische Studien ist. Wir haben das Protokoll eines abgeschwächten Stamm von M. beschriebenen Tuberkulose, mc ² 7000, mit einer Deletion in den zwei Loci, panCD und RD1, die kritisch für die in vivo das Wachstum des Erregers ⁹ sind. Dieser Stamm kann sicher in einer BSL-2 Containment werden für das Verständnis der biologischen Grundlagen der Tuberkulose-Erreger wodurch die Anforderung eines teuren BSL-3-Anlage verwendet. Die Methode kann erweitert werden, mit entsprechenden Modifikationen in den Medien, um Biofilm von anderen kultivierbaren Mykobakterien wachsen.

Insgesamt wird ein einheitliches Protokoll zur Kultivierung von Mykobakterien Biofilmen helfen den Ermittlern bei der Untersuchung der grundlegenden elastischen Eigenschaften von Mykobakterien interessiert. Darüber hinaus wird eine klare und präzise Verfahren zur Züchtung von Mykobakterien Biofilme auch helfen, die klinische und pharmazeutische investigators zur Prüfung der Wirksamkeit eines potentiellen Arzneimittels.

Protocol

1. Wachsende Biofilmen von M. Tuberkulose in einer 250ml-Flasche mit Schraubverschluss gelagert Medien-Herstellung: 0,5 g KH 2 PO 4, 0,5 g MgSO 4, 4g L-Asparagin, 2 g Zitronensäure, 0,05 g Eisenammoniumcitrat, 60ml von Glycerin in 900 ml Wasser. Der pH-Wert mit NaOH auf 7,0. Autoklav, abgekühlt und unmittelbar vor dem Beginn des Versuchs, fügen sterilen ZnSO 4 bis zu einer Endkonzentration von 0,1% w / v. Seit 7000 mc 2 ist ein Pantot…

Discussion

Tuberkulose (TB), durch die Infektion von Mycobacterium tuberculosis verursacht wird, bleibt eine große Bedrohung für die globale öffentliche Gesundheit. Fast ein Drittel der Weltbevölkerung schätzungsweise asymptomatisch durch den Erreger infiziert werden, zeigen etwa 9 Millionen neue Fälle in Klinik jedes Jahr mit den Symptomen einer aktiven TB und rund 1,7 Millionen sterben an der Infektion jedes Jahr ^11. Die enorme Belastung der Krankheit ist in erster Linie durch einen Mangel an einem Impf…

Materials

Equipment and supplies	SUPPLIER	CATALOG NUMBER
Incubator	VWR	Model # 1923/25
Polystyrene culture bottles	Fisher Scientific	03-374-300
12-well tissue culture plate	VWR	62406-165
50-mL conical tubes	VWR	89039-660
Rocker	Thermo Scientific	57019-662
Chromatographic refrigerator	VWR	55702-520
petri dish	VWR	25384-342
REAGENT	SUPPLIER	CATALOG NUMBER
KH2PO4 (monobasic)	EMD	PX1565-1
MgSO4	Fisher	M65-500
L-asparagine	Sigma	A4284-100G
citric acid	Sigma	C1857-100G
ferric ammonium citrate	Sigma	F5879-100G
glycerol	EMD	GX0185-5
NaOH	Sigma	S8045-500G
ZnSO4	Sigma	Z4750-500G
D-pantothenic acid	Sigma	P2250-25G
Difco Middlebrook 7H9 Broth	Becton Dickinson	271310
Middlebrook OADC Enrichment	BBL	212351
Tween-80	Fisher	T164-500
250mL storage bottle	Corning	430281
12 well plates	Falcon (BD)	353043
rifampicin	Sigma	R3501-1G
methanol	J.T. Baker	9070-05
10mlLsyringe	Becton Dickinson	301604
1-200μL pipet tips	VWR	89079-458
parafilm M	VWR	PM-996
15mL centrifuge tube	Greiner Bio-One	188-285
Difco Mycobacteria 7H11 Agar	Becton Dickinson	283810
NaCl	Fisher	BP358-1
KCl	Sigma	P9333-500G
Na2HPO4 (dibasic)	Sigma	S0876-500G