Werkwijze voor het isoleren van een retinacellen en vervolgens amplificatie van de cDNA beschreven. Single-cell transcriptomics onthult de mate van cellulaire heterogeniteit aanwezig is in een tissue en onthult nieuwe marker-genen voor zeldzame celpopulaties. De bijbehorende protocol kan worden aangepast aan verschillende celtypen te passen.
Zeer gespecialiseerde, maar zeer kleine populaties van cellen spelen een belangrijke rol in vele weefsels. De identificatie van cel-type specifieke markers en gen-expressie-programma's voor uiterst zeldzame cel subsets is een uitdaging met behulp van standaard hele weefsel benaderingen. Gene expression profiling van individuele cellen zorgt voor een ongekende toegang tot de celtypen die slechts een klein percentage van de totale weefsel 1-7 omvatten. Bovendien kan deze methode worden de genexpressie's die tijdelijk worden uitgedrukt in een klein aantal cellen gedurende dynamische ontwikkeling overgangen 8 onderzoeken.
Dit nummer van cellulaire diversiteit ontstaat herhaaldelijk in het centrale zenuwstelsel (CZS), waar de neuronale verbindingen kunnen ontstaan tussen zeer divers cellen 9. Het exacte aantal verschillende celtypen is niet precies bekend, maar het is geschat dat er sprake kan zijn maar liefst 1000 verschillende soorten in de cortex itself 10. De functie (s) van complexe neurale circuits kan beroepen op een aantal van de zeldzame neuronale types en de genen die ze uit te drukken. Door het identificeren van nieuwe markers en te helpen bij moleculair classificeren verschillende neuronen, de single-cell benadering is met name nuttig bij de analyse van celtypes in het zenuwstelsel. Het kan ook helpen om de mechanismen van neurale ontwikkeling toe te lichten door het identificeren van differentieel tot expressie genen en wegen tijdens de vroege stadia van de neuronale voorlopercellen ontwikkeling.
Als een eenvoudige, gemakkelijk te bereiken weefsel met veel neuronale diversiteit, de gewervelde netvlies is een uitstekend modelsysteem voor het bestuderen van de processen van ontwikkeling van de cellen, neuronale differentiatie en neuronale diversificatie. Echter, zoals in andere delen van het centrale zenuwstelsel, dit cellulair diversiteit kan een probleem vormen voor het bepalen van de genetische pathways die retinale voorouders rijden naar een specifieke lot van de cel vast te stellen, zeker gezien het feit dat staaf fotoreceptoren deel uitmaken van de mazal zijn van afwijkende de totale netvlies celpopulatie 11. Hier rapporteren een methode voor de identificatie van de transcripten uitgedrukt in een retinacellen (figuur 1). De single-cell profiling techniek maakt het mogelijk voor de beoordeling van het bedrag van heterogeniteit aanwezig in verschillende cellulaire populaties van het netvlies 2,4,5,12. Daarnaast is deze methode blijkt een groot aantal nieuwe kandidaat-genen die rol (len) kunnen spelen in het lot van de cel besluitvormingsprocessen die zich voordoen in subsets van het netvlies progenitorcellen 8. Met een aantal eenvoudige aanpassingen aan het protocol, kan deze techniek worden gebruikt voor veel verschillende weefsels en celtypes.
Een steeds groeiend aantal studies zijn onthullend robuuste cel-tot-cel variatie in populaties die werden geloofd om meer homogeen zijn met betrekking tot hun genexpressie 6,8. In ten minste een geval, dit genexpressie "ruis" blijkt een belangrijke biologische functie 13 spelen. Genexpressie verschillen tussen individuele cellen worden verduisterd met behulp van traditionele gehele weefsel methoden. Deze experimenten genereren de expressie profiel van een "gemiddelde" cel, die m…
The authors have nothing to disclose.
Reaction mixtures:
Cell Lysis buffer
0.45 μ | 10X reaction buffer (100 mM Tris-HCl pH 8.3, 500 mM KCl, 2 mM MgCl2) |
0.23 μl | 10% NP-40 |
0.23 μl | 0.1M DTT |
0.05 μl | RNase Inhibitor (40 U/μl) |
0.05 μl | SUPERase-In (20U/μl) |
0.13 μl | Modified Oligo d(T) primer (TATAGAATTCGCGGCCGCTCGCGATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT) |
0.09 μl | dNTPs (2.5 mM each) |
3.27 μl | dH20 (use molecular biology grade for all reaction mixtures) |
Tailing Reaction Mixture
0.18 μl | 100 mM dATP |
0.6 μl | 10X reaction buffer(100 mM Tris-HCl pH 8.3, 500 mM KCl, 2 mM MgCl2) |
4.62 μl | dH2O |
0.3 μl | TdT (400 U/μl) |
0.3 μl | RNase H (2 U/μl) |
PCR Reaction Mixture
10 μl | 10x Ex-Taq HS Buffer with Mg2+ |
10 μl | 2.5 mM dNTPs |
0.2 μl | Modified Oligo d(T) primer (10 μg/μl) |
1 μl | Ex-Taq HS Polymerase (5U/μl) |
68.8 μl | dH2O |
10X One-Phor All Buffer
0.5M | Potassium acetate |
0.1M | Tris acetate (pH 7.6) |
0.1M | Magnesium acetate |
Solutions:
10X Phosphate buffered saline (1 liter)
80g NaCl
2g KCl
14.4 g Na2PO4
2.4 g KH2PO4
adjust to pH 7.4 with NaOH and bring the volume to 1 liter with water
Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
Vertical needle puller | David Kopf Instruments | Model 750 | |
Microcapillary tubes | Sigma | P0674 | |
Aspirator tube assembly | Sigma | A5177 | |
Corning filter tips (100-1000 μl | Fisher Scientific | 07-200-265 | |
Hank’s balanced salt solution (1X) | Lonza BioWhittaker | 10-508F | |
HEPES buffer (1M) | MP Biomedicals | 091688449 | |
Bovine serum albumin | Sigma | A9418 | |
DNase I | Roche | 04716728001 | |
papain | Worthington | LS03126 | |
Superscript III | Invitrogen | 18080-044 | |
RNase Inhibitor | Applied Biosystems | AM2682 | These two RNase inhibitors seem to work the best. Contaminants present in other inhibitors can contribute to a background smear. |
SUPERase-In | Applied Biosystems | AM2694 | These two RNase inhibitors seem to work the best. Contaminants present in other inhibitors can contribute to a background smear. |
Modified Oligo d(T) primer (gel purified) | Oligos ETC | We have used primers purchased from many different companies and have seen the most reliable and reproducible results from Oligos ETC. | |
T4 gene 32 protein | New England Biolabs | M0300L | |
Exonuclease I | New England Biolabs | M0293S | |
TdT | Roche | 3 333 574 | As with other reagents, using a TdT enzyme from other companies gave more variable results. |
RNase H | Invitrogen | 18021-014 | |
Ex-Taq HS Polymerase | Takara | RR006A | |
Biotin N6-ddATP | Enzo Biosciences | 42809 |
Table 1. Specific reagents and equipment.