تم وصف طريقة لعزل خلايا الشبكية واحد، والتضخيم لاحق من cDNAs بهم. وحيدة الخلية transcriptomics يكشف عن درجة من عدم التجانس الحالي الخلوي في الأنسجة والجينات تكشف علامة جديدة للسكان الخلية نادر. ويمكن تعديل البروتوكول المرافق لتتناسب مع العديد من أنواع مختلفة من الخلايا.
السكان درجة عالية من التخصص، ولكنها صغيرة جدا من الخلايا تلعب دورا هاما في العديد من الأنسجة. وكان تحديد خلية من نوع علامات وبرامج محددة التعبير الجيني للخلية فرعية نادرة للغاية تحديا باستخدام معيار كامل الأنسجة النهج. التنميط الجيني التعبير من الخلايا الفردية تسمح للوصول لم يسبق لها مثيل إلى أنواع الخلايا التي تشكل إلا نسبة ضئيلة من مجموع النسيج 1-7. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام هذه التقنية لدراسة البرامج التعبير الجيني الذي يتم التعبير عن عابر في أعداد صغيرة من الخلايا خلال التحولات التنموية الحيوية 8.
هذه مسألة التنوع الخلوية تنشأ مرارا وتكرارا في الجهاز العصبي المركزي (CNS) حيث الوصلات العصبية يمكن أن يحدث بين خلايا مختلفة تماما 9. العدد الدقيق للأنواع الخلايا متميزة ليس معروفا على وجه التحديد، ولكن لم يقدر أنه قد يكون هناك ما يصل الى 1000 من أنواع مختلفة في القشرة أناtself 10. قد تكون وظيفة (ق) من الدوائر العصبية المعقدة الاعتماد على بعض أنواع الخلايا العصبية النادرة والجينات التي تعبر عنها. من خلال تحديد علامات جديدة وتساعد على تصنيف جزيئيا الخلايا العصبية المختلفة، ونهج وحيد الخلية هو مفيدة بشكل خاص في تحليل أنواع الخلايا في الجهاز العصبي. كما قد يساعد على توضيح آليات تطوره العصبي عن طريق تحديد الجينات وأعرب تفاضلي ومسارات الجينات خلال المراحل الأولى من التنمية سلف الخلايا العصبية.
كما منديل، بسيط الوصول إليها بسهولة مع تنوع كبير الخلايا العصبية، في شبكية العين عند الفقاريات هو نظام نموذجا ممتازا لدراسة عمليات التنمية الخلوية، وتمايز الخلايا العصبية وتنويع الخلايا العصبية. ومع ذلك، كما هو الحال في أجزاء أخرى من الجهاز العصبي المركزي، ويمكن لهذا التنوع الخلوية يمثل مشكلة لتحديد مسارات الوراثية التي تدفع الأسلاف شبكية العين إلى اعتماد مصير خلية معينة، وخصوصا ان مبصرات قضيب يشكلون أماهjority من السكان خلايا شبكية المجموع 11. هنا نقدم تقريرا عن طريقة لتحديد هوية النصوص التي أعرب عنها في خلايا الشبكية واحد (الشكل 1). أسلوب التنميط وحيدة الخلية يسمح لتقييم حجم السكان الحالي عدم التجانس داخل الخلوية المختلفة من شبكية العين 2،4،5،12. وبالإضافة إلى ذلك، فقد كشفت هذه الطريقة مجموعة من الجينات المرشحة الجديدة التي قد تلعب دور (ق) في مصير الخلية عمليات صنع القرار التي تحدث في مجموعات فرعية من الخلايا الاصلية في شبكية العين 8. مع بعض التعديلات البسيطة في البروتوكول، يمكن أن تستخدم هذه التقنية لأنسجة عديدة ومختلفة وأنواع الخلايا.
عدد الآخذة في التوسع من الدراسات التي تكشف عن قوة الخلية الى خلية التغير في السكان الذين يعتقد انهم كانوا أكثر تجانسا فيما يتعلق التعبير الجيني على 6،8. في واحدة على الأقل، وقد تبين أن هذا الجين التعبير عن "الضجيج" للعب وظيفة هامة البيولوجية 13. وتحجب ا?…
The authors have nothing to disclose.
Reaction mixtures:
Cell Lysis buffer
0.45 μ | 10X reaction buffer (100 mM Tris-HCl pH 8.3, 500 mM KCl, 2 mM MgCl2) |
0.23 μl | 10% NP-40 |
0.23 μl | 0.1M DTT |
0.05 μl | RNase Inhibitor (40 U/μl) |
0.05 μl | SUPERase-In (20U/μl) |
0.13 μl | Modified Oligo d(T) primer (TATAGAATTCGCGGCCGCTCGCGATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT) |
0.09 μl | dNTPs (2.5 mM each) |
3.27 μl | dH20 (use molecular biology grade for all reaction mixtures) |
Tailing Reaction Mixture
0.18 μl | 100 mM dATP |
0.6 μl | 10X reaction buffer(100 mM Tris-HCl pH 8.3, 500 mM KCl, 2 mM MgCl2) |
4.62 μl | dH2O |
0.3 μl | TdT (400 U/μl) |
0.3 μl | RNase H (2 U/μl) |
PCR Reaction Mixture
10 μl | 10x Ex-Taq HS Buffer with Mg2+ |
10 μl | 2.5 mM dNTPs |
0.2 μl | Modified Oligo d(T) primer (10 μg/μl) |
1 μl | Ex-Taq HS Polymerase (5U/μl) |
68.8 μl | dH2O |
10X One-Phor All Buffer
0.5M | Potassium acetate |
0.1M | Tris acetate (pH 7.6) |
0.1M | Magnesium acetate |
Solutions:
10X Phosphate buffered saline (1 liter)
80g NaCl
2g KCl
14.4 g Na2PO4
2.4 g KH2PO4
adjust to pH 7.4 with NaOH and bring the volume to 1 liter with water
Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
Vertical needle puller | David Kopf Instruments | Model 750 | |
Microcapillary tubes | Sigma | P0674 | |
Aspirator tube assembly | Sigma | A5177 | |
Corning filter tips (100-1000 μl | Fisher Scientific | 07-200-265 | |
Hank’s balanced salt solution (1X) | Lonza BioWhittaker | 10-508F | |
HEPES buffer (1M) | MP Biomedicals | 091688449 | |
Bovine serum albumin | Sigma | A9418 | |
DNase I | Roche | 04716728001 | |
papain | Worthington | LS03126 | |
Superscript III | Invitrogen | 18080-044 | |
RNase Inhibitor | Applied Biosystems | AM2682 | These two RNase inhibitors seem to work the best. Contaminants present in other inhibitors can contribute to a background smear. |
SUPERase-In | Applied Biosystems | AM2694 | These two RNase inhibitors seem to work the best. Contaminants present in other inhibitors can contribute to a background smear. |
Modified Oligo d(T) primer (gel purified) | Oligos ETC | We have used primers purchased from many different companies and have seen the most reliable and reproducible results from Oligos ETC. | |
T4 gene 32 protein | New England Biolabs | M0300L | |
Exonuclease I | New England Biolabs | M0293S | |
TdT | Roche | 3 333 574 | As with other reagents, using a TdT enzyme from other companies gave more variable results. |
RNase H | Invitrogen | 18021-014 | |
Ex-Taq HS Polymerase | Takara | RR006A | |
Biotin N6-ddATP | Enzo Biosciences | 42809 |
Table 1. Specific reagents and equipment.