Single-cell Profiling dei neuroni retinici maturi e in sviluppo

Summary

Un metodo per l'isolamento di singole cellule retiniche e successiva amplificazione del cDNA è descritto loro. Unicellulari trascrittomica rivela il grado di eterogeneità cellulare presente in un tessuto e scopre nuovi geni marcatori per le popolazioni di cellule rare. Il protocollo di accompagnamento può essere regolato secondo molti tipi cellulari differenti.

Abstract

Popolazioni altamente specializzati, ma estremamente piccola di cellule svolgono un ruolo importante in molti tessuti. L'identificazione di markers specifici delle cellule di tipo e programmi di espressione genica per sottopopolazioni cellulari estremamente rare è stata una sfida utilizzando le normali intero tessuto approcci. Profili di espressione genica di singole celle consente un accesso senza precedenti tipi di cellule che comprendono solo una piccola percentuale del tessuto totale ^1-7. Inoltre, questa tecnica può essere usata per esaminare i programmi di espressione genica che vengono espresse transitoriamente in piccoli numeri di cellule durante transizioni dinamiche di sviluppo ^8.

Questo problema della diversità cellulare si pone più volte nel sistema nervoso centrale (SNC) in cui le connessioni neuronali si può verificare tra le cellule molto diverse ^9. Il numero esatto di tipi cellulari diversi non è nota con precisione, ma è stato stimato che vi possono essere fino a 1000 diversi tipi nella corteccia itself ^10. La funzione (s) di complessi circuiti neuronali possono contare su alcuni dei tipi rare neuronali ei geni che esprimono. Identificando nuovi marcatori e contribuendo a classificare molecolarmente neuroni differenti, la singola cella approccio è particolarmente utile per l'analisi dei tipi di cellule del sistema nervoso. Può anche aiutare a chiarire i meccanismi di sviluppo neurale identificando i geni differenzialmente espressi e le vie del gene durante le prime fasi dello sviluppo progenitore neuronale.

Come un semplice, il tessuto facilmente accessibili con notevole diversità neuronale, la retina dei vertebrati è un sistema eccellente modello per lo studio dei processi di sviluppo cellulare, la differenziazione neuronale e la diversificazione neuronale. Tuttavia, come in altre parti del sistema nervoso centrale, questa diversità cellulare può rappresentare un problema per la determinazione dei percorsi genetici che guidano progenitrici della retina di adottare un destino specifico della cellula, soprattutto considerando che bastoncelli costituiscono la magioranza della popolazione totale delle cellule della retina ^11. Qui riportiamo un metodo per l'identificazione dei trascritti espressi in singole cellule retiniche (Figura 1). La cella singola tecnica di profilatura consente la valutazione della quantità di eterogeneità presente all'interno diverse popolazioni cellulari della retina ^2,4,5,12. Inoltre, questo metodo ha rivelato una serie di nuovi geni che può svolgere il ruolo (s) nel fato cella processi decisionali che si verificano in sottogruppi di cellule progenitrici retiniche ^8. Con alcune semplici regolazioni per il protocollo, questa tecnica può essere utilizzato per molti tessuti e tipi di cellule.

Protocol

1. Dissociazione cellulare Un diagramma di flusso che illustra il protocollo viene mostrata è Figura 1. Per i numeri di catalogo dei particolari reagenti usati in questo protocollo, si prega di fare riferimento alla Tabella 1. Sezionare la retina in un bagno PBS. Durante la dissezione, è preferibile rimuovere il vitreo e la lente dal tenendoli con la retina può impedire la dissociazione. Non è sempre di fondamentale importanza per rimuovere tutto l'epitelio pigmentato…

Discussion

Un sempre crescente numero di studi stanno rivelando robusta cellula-cellula variabilità nelle popolazioni che sono state ritenute più omogenee per quanto riguarda la loro espressione genica ^6,8. In almeno un caso, questa espressione genica "rumore" ha dimostrato di giocare un importante funzione biologica ^13. Le differenze di espressione genica tra le singole cellule sono oscurate con i tradizionali metodi di interi tessuti. Questi esperimenti generare il profilo di espressione di una …

Materials

Reaction mixtures:

Cell Lysis buffer

0.45 μ	10X reaction buffer (100 mM Tris-HCl pH 8.3, 500 mM KCl, 2 mM MgCl2)
0.23 μl	10% NP-40
0.23 μl	0.1M DTT
0.05 μl	RNase Inhibitor (40 U/μl)
0.05 μl	SUPERase-In (20U/μl)
0.13 μl	Modified Oligo d(T) primer (TATAGAATTCGCGGCCGCTCGCGATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT)
0.09 μl	dNTPs (2.5 mM each)
3.27 μl	dH20 (use molecular biology grade for all reaction mixtures)

Tailing Reaction Mixture

0.18 μl	100 mM dATP
0.6 μl	10X reaction buffer(100 mM Tris-HCl pH 8.3, 500 mM KCl, 2 mM MgCl2)
4.62 μl	dH2O
0.3 μl	TdT (400 U/μl)
0.3 μl	RNase H (2 U/μl)

PCR Reaction Mixture

10 μl	10x Ex-Taq HS Buffer with Mg2+
10 μl	2.5 mM dNTPs
0.2 μl	Modified Oligo d(T) primer (10 μg/μl)
1 μl	Ex-Taq HS Polymerase (5U/μl)
68.8 μl	dH2O

10X One-Phor All Buffer

0.5M	Potassium acetate
0.1M	Tris acetate (pH 7.6)
0.1M	Magnesium acetate

Solutions:

10X Phosphate buffered saline (1 liter)

80g NaCl
2g KCl
14.4 g Na₂PO₄
2.4 g KH₂PO₄
adjust to pH 7.4 with NaOH and bring the volume to 1 liter with water

Name of the reagent	Company	Catalog number	Comments
Vertical needle puller	David Kopf Instruments	Model 750
Microcapillary tubes	Sigma	P0674
Aspirator tube assembly	Sigma	A5177
Corning filter tips (100-1000 μl	Fisher Scientific	07-200-265
Hank’s balanced salt solution (1X)	Lonza BioWhittaker	10-508F
HEPES buffer (1M)	MP Biomedicals	091688449
Bovine serum albumin	Sigma	A9418
DNase I	Roche	04716728001
papain	Worthington	LS03126
Superscript III	Invitrogen	18080-044
RNase Inhibitor	Applied Biosystems	AM2682	These two RNase inhibitors seem to work the best. Contaminants present in other inhibitors can contribute to a background smear.
SUPERase-In	Applied Biosystems	AM2694	These two RNase inhibitors seem to work the best. Contaminants present in other inhibitors can contribute to a background smear.
Modified Oligo d(T) primer (gel purified)	Oligos ETC		We have used primers purchased from many different companies and have seen the most reliable and reproducible results from Oligos ETC.
T4 gene 32 protein	New England Biolabs	M0300L
Exonuclease I	New England Biolabs	M0293S
TdT	Roche	3 333 574	As with other reagents, using a TdT enzyme from other companies gave more variable results.
RNase H	Invitrogen	18021-014
Ex-Taq HS Polymerase	Takara	RR006A
Biotin N6-ddATP	Enzo Biosciences	42809

Table 1. Specific reagents and equipment.