Метод для выделения одной клетки сетчатки и последующему усилению их кДНК описаны. Одноклеточный транскриптомику показывает степень сотовой настоящее время неоднородность ткани и открывает новые маркерных генов редких клеточных популяций. Сопровождающих протокол может быть скорректирована в соответствии с различными типами клеток.
Узкоспециализированные, но очень небольшие популяции клеток играют важную роль во многих тканях. Определение клеточного типа маркеров и программы для экспрессии генов крайне редки подмножества клетка была проблема с использованием стандартных все ткани подходов. Экспрессия генов профилирования отдельных клеток позволяет беспрецедентный доступ к типам клеток, которые составляют лишь небольшой процент от общей ткани 1-7. Кроме того, эта методика может быть использована для изучения экспрессии генов программы, которые временно выражается в небольшом количестве клеток в процессе динамического развития переходов 8.
Этот выпуск сотовых разнообразие возникает повторно в центральной нервной системе (ЦНС), где нейронные связи могут возникнуть между весьма разнообразны клеток 9. Точное число различных типов клеток, точно не известно, но было подсчитано, что там может быть больше, чем 1000 различных типов в коре яtself 10. Функция (ы) сложные нейронные цепи могут рассчитывать на некоторые редкие типы нейронов и генов, которые они выражают. По выявлению новых маркеров и помогает молекулярно классифицировать различные нейроны, одноклеточные подход особенно полезен при анализе типов клеток в нервной системе. Это также может помочь выяснить механизмы развития нервной системы путем выявления разному экспрессируются гены и ген пути на ранних стадиях развития нейронных предшественников.
В качестве простого, легко доступны ткани с большим разнообразием нейронов, сетчатки позвоночных является отличной модельной системой для изучения процессов клеточного развития, нейронов и нейронных дифференциации диверсификации. Однако, как и в других отделах центральной нервной системы, этот сотовый разнообразие может представлять собой проблему для определения генетических путей, которые ведут сетчатки предшественников принять конкретные судьбы клетки, особенно учитывая, что стержень фоторецепторов составляют машинство общей популяции клеток сетчатки 11. Здесь мы приводим метод для идентификации протоколов выразил в одной клетки сетчатки (рис. 1). Одноклеточные профилирования метод позволяет для оценки количества неоднородность настоящее время в различных клеточных популяций сетчатки 2,4,5,12. Кроме того, этот метод выявил целый ряд новых генов-кандидатов, которые могут играть роль (ы) в клетке судьбы процессах принятия решений, которые происходят в подмножества сетчатки клеток-предшественников 8. С помощью нехитрых изменений в протокол, этот метод может быть использован для различных тканей и типов клеток.
Постоянно расширяющийся ряд исследований выявления надежных клетки к клетке изменчивость в популяциях, которые считались более однородными с точки зрения их экспрессии гена 6,8. По крайней мере в одном случае, это экспрессия генов "шум", как было показано, играют важную биоло…
The authors have nothing to disclose.
Reaction mixtures:
Cell Lysis buffer
0.45 μ | 10X reaction buffer (100 mM Tris-HCl pH 8.3, 500 mM KCl, 2 mM MgCl2) |
0.23 μl | 10% NP-40 |
0.23 μl | 0.1M DTT |
0.05 μl | RNase Inhibitor (40 U/μl) |
0.05 μl | SUPERase-In (20U/μl) |
0.13 μl | Modified Oligo d(T) primer (TATAGAATTCGCGGCCGCTCGCGATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT) |
0.09 μl | dNTPs (2.5 mM each) |
3.27 μl | dH20 (use molecular biology grade for all reaction mixtures) |
Tailing Reaction Mixture
0.18 μl | 100 mM dATP |
0.6 μl | 10X reaction buffer(100 mM Tris-HCl pH 8.3, 500 mM KCl, 2 mM MgCl2) |
4.62 μl | dH2O |
0.3 μl | TdT (400 U/μl) |
0.3 μl | RNase H (2 U/μl) |
PCR Reaction Mixture
10 μl | 10x Ex-Taq HS Buffer with Mg2+ |
10 μl | 2.5 mM dNTPs |
0.2 μl | Modified Oligo d(T) primer (10 μg/μl) |
1 μl | Ex-Taq HS Polymerase (5U/μl) |
68.8 μl | dH2O |
10X One-Phor All Buffer
0.5M | Potassium acetate |
0.1M | Tris acetate (pH 7.6) |
0.1M | Magnesium acetate |
Solutions:
10X Phosphate buffered saline (1 liter)
80g NaCl
2g KCl
14.4 g Na2PO4
2.4 g KH2PO4
adjust to pH 7.4 with NaOH and bring the volume to 1 liter with water
Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
Vertical needle puller | David Kopf Instruments | Model 750 | |
Microcapillary tubes | Sigma | P0674 | |
Aspirator tube assembly | Sigma | A5177 | |
Corning filter tips (100-1000 μl | Fisher Scientific | 07-200-265 | |
Hank’s balanced salt solution (1X) | Lonza BioWhittaker | 10-508F | |
HEPES buffer (1M) | MP Biomedicals | 091688449 | |
Bovine serum albumin | Sigma | A9418 | |
DNase I | Roche | 04716728001 | |
papain | Worthington | LS03126 | |
Superscript III | Invitrogen | 18080-044 | |
RNase Inhibitor | Applied Biosystems | AM2682 | These two RNase inhibitors seem to work the best. Contaminants present in other inhibitors can contribute to a background smear. |
SUPERase-In | Applied Biosystems | AM2694 | These two RNase inhibitors seem to work the best. Contaminants present in other inhibitors can contribute to a background smear. |
Modified Oligo d(T) primer (gel purified) | Oligos ETC | We have used primers purchased from many different companies and have seen the most reliable and reproducible results from Oligos ETC. | |
T4 gene 32 protein | New England Biolabs | M0300L | |
Exonuclease I | New England Biolabs | M0293S | |
TdT | Roche | 3 333 574 | As with other reagents, using a TdT enzyme from other companies gave more variable results. |
RNase H | Invitrogen | 18021-014 | |
Ex-Taq HS Polymerase | Takara | RR006A | |
Biotin N6-ddATP | Enzo Biosciences | 42809 |
Table 1. Specific reagents and equipment.