Encelliga Profilering av u och mogen näthinneneuroner

Summary

En metod för isolering av enskilda retinala celler och efterföljande amplifiering av deras cDNA är beskriven. Encelliga transkriptomik avslöjar graden av cellulär heterogenitet som finns i en vävnad och avslöjar nya markörgener för sällsynta cellpopulationer. Den åtföljande protokollet kan anpassas för att passa många olika celltyper.

Abstract

Högspecialiserade, men ytterst små populationer av celler spelar en viktig roll i många vävnader. Identifieringen av cell-typspecifika markörer och gener program uttryck för extremt sällsynta cellundergrupper har varit en utmaning med normala hela-vävnad metoder. Gene expression profiling av individuella celler möjliggör oöverträffad tillgång till celltyper som utgör endast en liten andel av den totala vävnaden ^1-7. Dessutom kan denna teknik användas för att undersöka de program genuttryck som transient uttrycks i små antal celler under dynamiska utvecklingsmässiga övergångar ^8.

Detta nummer av cellulära mångfald uppstår upprepade gånger i det centrala nervsystemet (CNS) där neuronala kopplingar kan förekomma mellan ganska olika celler ^9. Det exakta antalet distinkta celltyper är inte exakt känd, men det har uppskattats att det kan finnas så många som 1000 olika typer i hjärnbarken itself ^10. Funktionen (s) av komplexa neurala kretsar kan förlita sig på några av de sällsynta neuronala typerna och de gener de uttrycker. Genom att identifiera nya markörer och hjälpa till att molekylärt klassificera olika nervceller, är encelliga strategi särskilt användbart vid analys av celltyper i nervsystemet. Det kan också bidra till att belysa mekanismerna för neural utveckling genom att identifiera differentiellt uttryckta gener och vägar gen under tidiga stadier av neuronala stamceller utveckling.

Som en enkel, lättillgänglig vävnad med stor neuronal mångfald är ryggradsdjuret näthinnan en utmärkt modell för att studera processer för cellulär utveckling, neuronal differentiering och neuronal diversifiering. Men liksom i andra delar av CNS, kan denna cellulära mångfald ett problem för att bestämma de genetiska vägar som driver retinala progenitorceller att anta en specifik cell öde, särskilt med tanke på att stavar utgör maritetsbeslut av den totala retinala cell-populationen ^11. Här rapporterar vi en metod för identifiering av transkripten som uttrycks i enkla retinala celler (figur 1). Den encelliga profilering tekniken gör det möjligt att bedöma av mängden heterogenitet finns inom olika cellulära populationer av näthinnan ^2,4,5,12. Dessutom har denna metod visat en mängd nya kandidatgener som kan spela roll (er) i cellen öde beslutsprocesser som sker i delmängder av retinala stamceller ^8. Med några enkla justeringar av protokollet, kan denna teknik användas för många olika vävnader och celltyper.

Protocol

1. Celldissociation Ett flödesschema som beskriver protokollet visas är figur 1. För katalognummer på de speciella reagenser som används i hela detta protokoll, se tabell 1. Dissekera näthinnan i en PBS-bad. Under dissektion, är det bäst att avlägsna glaskroppen och linsen sedan hålla dem med näthinnan kan hämma dissociation. Det är inte alltid kritiskt viktigt att avlägsna allt av det retinala pigmentepitelet (RPE) och i vissa fall kan det vara omöjligt att fu…

Discussion

En ständigt växande antal studier avslöjar robust cell till cell variation i populationer som ansågs vara mer homogena med avseende på deras genuttryck ^6,8. I åtminstone ett fall har detta genuttryck "brus" visat sig spela en viktig biologisk funktion ^13. Genuttryck skillnader mellan enskilda celler skyms med traditionella av hela vävnad metoder. Dessa experiment genererar uttryck profilen för en "genomsnittlig" cell, vilket kanske inte är representativa ^14. …

Materials

Reaction mixtures:

Cell Lysis buffer

0.45 μ	10X reaction buffer (100 mM Tris-HCl pH 8.3, 500 mM KCl, 2 mM MgCl2)
0.23 μl	10% NP-40
0.23 μl	0.1M DTT
0.05 μl	RNase Inhibitor (40 U/μl)
0.05 μl	SUPERase-In (20U/μl)
0.13 μl	Modified Oligo d(T) primer (TATAGAATTCGCGGCCGCTCGCGATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT)
0.09 μl	dNTPs (2.5 mM each)
3.27 μl	dH20 (use molecular biology grade for all reaction mixtures)

Tailing Reaction Mixture

0.18 μl	100 mM dATP
0.6 μl	10X reaction buffer(100 mM Tris-HCl pH 8.3, 500 mM KCl, 2 mM MgCl2)
4.62 μl	dH2O
0.3 μl	TdT (400 U/μl)
0.3 μl	RNase H (2 U/μl)

PCR Reaction Mixture

10 μl	10x Ex-Taq HS Buffer with Mg2+
10 μl	2.5 mM dNTPs
0.2 μl	Modified Oligo d(T) primer (10 μg/μl)
1 μl	Ex-Taq HS Polymerase (5U/μl)
68.8 μl	dH2O

10X One-Phor All Buffer

0.5M	Potassium acetate
0.1M	Tris acetate (pH 7.6)
0.1M	Magnesium acetate

Solutions:

10X Phosphate buffered saline (1 liter)

80g NaCl
2g KCl
14.4 g Na₂PO₄
2.4 g KH₂PO₄
adjust to pH 7.4 with NaOH and bring the volume to 1 liter with water

Name of the reagent	Company	Catalog number	Comments
Vertical needle puller	David Kopf Instruments	Model 750
Microcapillary tubes	Sigma	P0674
Aspirator tube assembly	Sigma	A5177
Corning filter tips (100-1000 μl	Fisher Scientific	07-200-265
Hank’s balanced salt solution (1X)	Lonza BioWhittaker	10-508F
HEPES buffer (1M)	MP Biomedicals	091688449
Bovine serum albumin	Sigma	A9418
DNase I	Roche	04716728001
papain	Worthington	LS03126
Superscript III	Invitrogen	18080-044
RNase Inhibitor	Applied Biosystems	AM2682	These two RNase inhibitors seem to work the best. Contaminants present in other inhibitors can contribute to a background smear.
SUPERase-In	Applied Biosystems	AM2694	These two RNase inhibitors seem to work the best. Contaminants present in other inhibitors can contribute to a background smear.
Modified Oligo d(T) primer (gel purified)	Oligos ETC		We have used primers purchased from many different companies and have seen the most reliable and reproducible results from Oligos ETC.
T4 gene 32 protein	New England Biolabs	M0300L
Exonuclease I	New England Biolabs	M0293S
TdT	Roche	3 333 574	As with other reagents, using a TdT enzyme from other companies gave more variable results.
RNase H	Invitrogen	18021-014
Ex-Taq HS Polymerase	Takara	RR006A
Biotin N6-ddATP	Enzo Biosciences	42809

Table 1. Specific reagents and equipment.