ECIS / Taksiler ile Hücresel Kemotaksis Ölçümü
Summary
ECIS / Taksiler sistemi hücresel kemotaksis ölçer otomatik, gerçek zamanlı bir testtir. Bu deneyde, bir hedef hücreler elektrot varmak için agaroz bir katmanı altındaki hareket eder. Hücresel hareketi AC akım 0 direnç başlangıcı ile ölçülür.
Abstract
Dış uyaranlara yanıt Hücresel hareket yara iyileşmesi, enflamasyon ve enfeksiyona yanıt dahil, birçok hücresel süreçleri için esastır. Kemotaksi ölçmek için ortak bir yöntem hücreleri ve kemoatraktan bir gözenekli zar ile ayrılmış edildiği Boyden haznesi assay vardır. Hücreleri kemoatraktan doğru zarından göç gibi, onlar membran veya temel ortamı içine düşme alt uymak ve daha sonra boyandı ve görsel 1 sayılır. Bu yöntemde, hücreler dokuları 2'de bulunan geçişlerini kötü bir temsil olduğu düşünülmektedir dik ve geçici kemoatraktan degrade, maruz kalmaktadır.
Başka bir deney sisteminde, altında-agaroz kemotaksi deneyi, 3, agaroz tabakasının altında oluşturan bir sulu ince film bir alt tabaka arasında bir katı 4 önlemleri hücre hareketi. Agaroz gelişir degrade sığ ve bir uygulama olduğu düşünülmektedirdoğal eğimleri meydana gelen temsili uygun olur. Kemotaksis katedilen mesafe mikroskopik görüntüleme ile değerlendirilebilir. Boyden çemberinin tahlil ve altı agaroz testi genellikle iki nokta deneyleri olarak yapılandırılır.
Otomatik ECIS / Taksiler sistemi Elektrik Hücre-substrat Empedans Algılama (ECIS) 5, 6 altı agaroz yaklaşımı birleştirir. Bu deneyde, hedef elektrotlar 8 odalarına her yer alır. Büyük bir karşı-elektrot 8 odalarına (Şekil 2) her biri aracılığıyla çalışır. Her bir odacık agaroz ile doldurulur ve iki küçük kuyu hedef elektrot her iki tarafında da agaroz kesilmiş olan edilir. Diğer difüzyon kemoatraktan kaynakları (Şekil 3) tutarken biri de, test hücre popülasyonu ile doludur. Sistem geçirilir Mevcut hücreleri hedef elektrot üzerine çıkması olarak ortaya çıkar direnç değişim belirlemek için kullanılabilir. Hedef Hücreler elektrodlarıe sistemi 6 direncini artırır. Buna ek olarak, dalgalanma direnci hızlı elektrot yüzey ile hücre etkileşim içinde değişikliklerin temsil eden ve hücresel şekil değişikliği işaret etmektedir. ECIS / Taksiler sistemi uzun süre üzerinden gerçek zamanlı olarak hücre popülasyonunun hareketini ölçmek değil, aynı zamanda hedef elektrot tek bir hücrenin varış algılayacak kadar duyarlıdır.
Dictyostelium discoidium bir folat gradyanı 7, 8 ve kemotaktik tepkisi doğru ECIS / Taxis 9 ile ölçülebilir varlığında geçirmek bilinmektedir. Lökosit kemotaksi, SDF1α ve kemotaksi antagonistleri yanıt olarak, aynı zamanda ECIS / Taksiler 10, 11 ile ölçülmüştür. SDF1α için lökosit tepkisi bir örnek Şekil 1 'de gösterilmiştir.
Protocol
Discussion
ECIS / Taksiler testinin roman özelliklerine hücreleri kemoatraktan yanıt olarak gerçek zamanlı veri toplama otomatikleştirmek yeteneğini içerir. Bu teknolojinin en yaygın uygulama bireysel kemotaktik gradientinden hücresel tepkileri ölçmek veya kemotaksis agonistleri ve antagonistleri karışımlarından oluşan gradientinden üzere iken, ECIS / Taksiler yaklaşımı da oldukça yararlı olabilecek bu yapılandırmalar için varyasyonların mükellef olduğu hücresel yanıt değerlendirilmesi. Örtüşen v…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (ES07408 ve EB00208) hibe ile desteklenmiştir.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog number | Comments |
| ECIS Zθ | Applied Biophysics | http://www.biophysics.com/prodducts_Ecisz0.php | |
| ECIS Electrode Array | Applied Biophysics | 8W Chemotaxis | http://www.biophysics.com/cultureware.php |
| Seakem GTG agarose | BioWhittaker Molecular Applications | 50070 | |
| RPMI1640 | Cellgro | 10-040 | |
| HyClone Fetal Bovine Serum | Thermo Scientific | SH300703 | |
| Penicillin/Streptomycin | MP Biomedicals | 1670049 | Penicillin 5,000 IU/ml; Streptomycin 5 mg/ml |
| HEPES Buffer | MP Biomedicals | 1688449 | 1M solution, cell culture grade |
| 14 Gauge stainless steel Cannula (2) 4 inch | General Laboratory Supply | 5-8365-1 | Blunt point |
References
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).
- Lauffenburger, D. A., Tranquillo, R. T., Zigmond, S. H. Concentration gradients of chemotactic factors in chemotaxis assays. Methods Enzymol. 162, 85-101 (1988).
- Nelson, R. D., Quie, P. G., Simmons, R. L. Chemotaxis under agarose: a new and simple method for measuring chemotaxis and spontaneous migration of human polymorphonuclear leukocytes and monocytes. J. Immunol. 115, 1650-1650 (1975).
- Newton-Nash, D. K., Tonellato, P., Swiersz, M., Abramoff, P. Assessment of chemokinetic behavior of inflammatory lung macrophages in a linear under-agarose assay. J. Leukoc. Biol. 48, 297-305 (1990).
- Giaever, I., Keese, C. R. Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 3761-374 (1984).
- Keese, C. G. I. A Whole Cell Biosensor bsed on Cell-Substrate Interactions. IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. 12, 500-501 (1990).
- Laevsky, G., Knecht, D. A. Cross-linking of actin filaments by myosin II is a major contributor to cortical integrity and cell motility in restrictive environments. J. Cell. Sci. 116, 3761-3770 (2003).
- Condeelis, J., Bresnick, A., Demma, M., Dharmawardhane, S., Eddy, R., Hall, A. L., Sauterer, R., Warren, V. Mechanisms of amoeboid chemotaxis: an evaluation of the cortical expansion. 11, 5-6 (1990).
- Hadjout, N., Laevsky, G., Knecht, D. A., Lynes, M. A. Automated real-time measurement of chemotactic cell motility. Biotechniques. 31, 1130-1138 (2001).
- Hadjout, N., Yin, X., Knecht, D. A., Lynes, M. A. Automated real-time measurements of leukocyte chemotaxis. J. Immunol. Methods. 320, 70-80 (2007).
- Yin, X., Knecht, D. A., Lynes, M. A. Metallothionein mediates leukocyte chemotaxis. BMC Immunol. 6, 21-21 (2005).
- Lundien, M. C., Mohammed, K. A., Nasreen, N., Tepper, R. S., Hardwick, J. A., Sanders, K. L., Van Horn, R. D., Antony, V. B. Induction of MCP-1 expression in airway epithelial cells: role of CCR2 receptor in airway epithelial injury. J. Clin. Immunol. 22, 144-152 (2002).
- Zudaire, E., Cuesta, N., Murty, V. The aryl hydrocarbon receptor repressor is a putative tumor suppressor gene in multiple human cancers. J. Clin. Invest. 118, 640-650 (2008).
- Opp, D., Wafula, B., Lim, J., Huang, E., Lo, J. C., Lo, C. M. Use of electric cell-substrate impedance sensing to assess in vitro cytotoxicity. Biosens. Bioelectron. 24, 2625-269 (2009).
- Foxman, E. F., Kunkel, E. J., Butcher, E. C. Integrating conflicting chemotactic signals. The role of memory in leukocyte navigation. J. Cell. Biol. 147, 577-588 (1999).
- Heit, B., Tavener, S., Raharjo, E., Kubes, P. An intracellular signaling hierarchy determines direction of migration in opposing chemotactic gradients. J. Cell. Biol. 159, 91-102 (1999).
