AVEXIS hücresel tanıma süreçlerinde roman dışı reseptör-ligand çiftleri için sistematik ekran için geliştirilmiş bir yüksek verimlilik protein etkileşim testtir. Bu özellikle diğer yüksek verimlilik yaklaşımları kullanarak tespit etmek zordur geçici protein etkileşimleri tespit etmek için tasarlanmıştır.
Hücre dışı protein: salgılanan veya membran-gergin proteinler arasındaki protein etkileşimleri Çok hücreli organizmalarda hem de hücreler arası iletişimi başlatma ve uyum sağlamak için önemlidir. Proteinler hücre dışı etkileşimlerin insan genlerinin 1 yaklaşık dörtte bir oranında kodlanmış oluşturmak için tahmin edilen, ancak önemi ve bolluğuna rağmen, bu proteinlerin çoğunluğu hiçbir bağlayıcı ortağı belgelenmiştir. Öncelikle, bu onların biyokimyasal inatçılığı nedeniyle: membran-gömülü proteinler kendi doğal yapısındaki çözünebilmesi zordur ve yapısal-posttranslasyonel önemli değişiklikler içerir. Ayrıca, reseptör proteinler arasındaki etkileşimi akrabalıklar genellikle çok sık kullanılan, yüksek verimlilik yöntemleri 2 ile tespit engelleyen son derece düşük etkileşimi güçlü (yarılanma ömrü <1 saniye) ile karakterizedir.
Burada, AVEXIS (avidite tabanlı ekstraselüler, bir deneyi tarifdüşük yalancı pozitiflik oranı 3 ile çok zayıf protein etkileşimleri (t 1/2 ≤ 0.1 sn) tespiti sağlayan bu teknik zorlukların üstesinden lar Etkileşimi Ekran). Assay genellikle uygun bir mikrotitre plakası biçiminde etkileşimler (Şekil 1) binlerce sistematik tarama sağlamak için yüksek bir verim biçimde uygulanmaktadır. Bu etkileşimler için taranması için, içinde hücre yüzey reseptörü veya salgılanan proteinlerin ectodomain parçaları içeren çözünür rekombinant protein üretime kütüphaneleri dayanır, bu nedenle, bu yaklaşım tipi için uygun olan I, tip II, GPI-bağlı hücre yüzey reseptörleri ve salgılanmış proteinler değil, iyon kanalları ya da taşıyıcı olarak multipass membran proteinleri için.
Rekombinant protein kütüphaneler gibi glycosyla gibi önemli posttranslasyonel değişiklikler sağlamak için, uygun ve yüksek seviyeli memeli ifade sistem 4 kullanılarak üretilmektedirTION ve disülfit bağları eklenir. Taraması için uygun bir streptavidin kaplı bir katı faz üzerinde yakalandı edilebilir bir biyotinile yem, ve bir pentamerised enzim-etiketli (β-laktamaz) av: ifade edilen rekombinant proteinlerin, orta ve iki formda üretilen salgılanmaktadır. Yem ve av proteinleri geleneksel bir ELISA (Şekil 1) 'e benzer bunlar arasında doğrudan etkileşimler, tespit etmek için bir ikili şekilde birbirine sunulmaktadır. Av in proteinlerin pentamerisation kıkırdak oligomerik matriks proteini (COMP) bir peptid sekansı ile gerçekleştirilir ve böylece daha çok geçici etkileşimler tespit edilebilir sağlamak için önemli bir avidite kazancı sağlanması ectodomains lokal konsantrasyonunu artırır. Yem ve tarama öncesinde önceden belirlenen seviyelere av hem de faaliyetlerini normalleştiren, biz 0.1 sn monomerik yarı ömrü olan etkileşimleri düşük yanlış pozitif oranları 3 ile tespit edilebilir olduğunu göstermiştir.
Canlı hücreler in vivo olarak incelenirse, bunların plazma membranları son derece dinamik davranışları sergilerler: onlar ulaşın ve komşularıyla 2 ile iletişim olarak uzanan ve kesintili olarak membran prosesleri. Bu temasların birçok arabuluculuk membran-gömülü reseptör proteinler arasındaki fiziksel etkileşim bu son derece hareketli davranış izin verecek şekilde son derece zayıf olduğu için evrim geçirmiştir. Bu 50 uM olarak zayıf gibi monomerik etkileşimi son derece güçlü 2,10 meydan roman etkileşimleri tespit yapar fizyolojik reseptör yoğunlukları 9 spontan etkileşimleri sürmek için yeterli olabileceği tahmin edilmiştir. Düşük yalancı pozitiflik oranı ile ölçeklenebilir bir şekilde uygulanabilir protein etkileşimleri: Burada anlatılan AVEXIS yöntemi geçici ekstraselüler proteini tespit için hassas bir yöntem sağlar. Diğer yöntemler ölçülebilir, hücre dışı etkileşimler 11-15 algılamak için geliştirilmiştir ikenAVEXIS bir avantaj gibi yem ve av faaliyetleri gibi deneysel parametrelerin düşük yalancı pozitiflik oranı 3 korurken bile (t 1/2 ≤ 0,1 s) etkileşimlerin zayıf algılamak için sayısal edilmiş olmasıdır. Buna ek olarak, akıcı ve sağlam numune hazırlama usul diğer testlere göre çok daha büyük ölçekte uygulanacak bu testte sağladı ve biz son ~ 16,500 potansiyel etkileşimleri üzerinde 16 toplam sistematik bir etkileşim ekranı tarif var.
Tahlil, bir çözünür rekombinant protein parçası ifade etmek mümkün olduğu için herhangi bir proteini üzerinde gerçekleştirilebilir. Bu nedenle bu tip I, GPI-bağlantılıdır ve salgılanan proteinler gibi bir N-terminal sinyal peptit içeren protein içerir. Yakın zamanda şimdi bize yemler 17 olarak tip II proteinleri ifade edebilecekleri vektörler bir paketi tasarladık. Deneyi, genellikle bu tür iyon taşıyıcı olarak multipass zar proteinleri için uygun değildirs ya da doğru bir plazma zarı bağlamı dışında katlanmış olması olası değildir beri pompalar. Biz zebrabalıkları 3,16,18, insan, fare ve P. hücre dışı proteinler farklı bir sistem çeşitliliği için bu başvurmuş ve başarıyla ifade ettiler etkileşim ekranlar için falciparum.
Bir AVEXIS ekran kurmak için gerekli kaynakları açısından, biz önemli bir darboğaz seçimi, inşaat, ve ifade plazmid dolu sıralama olduğunu bulduk. Yöntemi bu yönü ~ 100 yem ve yırtıcı yapılar yapmak için bir yıl kadar sürebilir, ancak, gen sentezi azalan maliyet, şimdi projenin bu yönü dış kaynak ticari lehine. Büyük bir titreme doku kültürü inkübatör (biz bir INFORS HT Multitron Hücre kullanın) ile birlikte memeli ekspresyon sistemi ifade ve ~ 100 yem ve yırtıcı proteinleri bir ay kadar normalleştirmek için tek bir araştırmacı sağlar. Proteinler üretilen ve s, normalize edilir kezetkileşimleri için creening rahatlıkla günlük işlenen on iki kadar 96-plakaları ile hızlıdır. Bu tür proteinleri çok sayıda üretimi kolaylaştırmak için geliştirilmiş ki yalnızca ısmarlama ekipmanı paralel bir 0.22μm filtre ile beş süpernatanlar kadar geçmesi için kullanılan bir sıkıştırılmış hava tazyikli bir piston.
Bu etkileşimlerin bazıları 3 tespit edilebilir ancak literatürde (yanlış negatif) beklenen etkileşimleri göre cevapsız olabilir etkileşimlerin ana sınıfı, homophilic etkileşimleri vardır. Beklenen etkileşimleri tespit edilmez durumlarda, bu daha sonra immobilize yem proteinleri ile daha fazla etkileşim engeller av proteinler (bir av "maskeleme" etkisi) tarafından homophilic etkileşimlerin oluşumundan dolayı olduğuna inanıyorum. Etkileşimler tespit edilir frekansı taranan proteini kütüphanesinin içeriği bağlıdır. Okuyucu için bir rehber,> 30 bir ekran olarak, Zebrabalıkları immünglobülin süper ailesi içinde 000 etkileşimleri 188 pozitif sonuçlandı -% 0.6 3,16,18 bir frekans. Herhangi bir olumlu hit doğrulamak için yapılabilir çok çabuk kontrol etkileşimi yem-av yönelimleri hem de tespit edilebilir olup olmadığını belirlemek için;, aynı etkileşimi bir yem ya olarak bağlayıcı proteinlerin mevcut olup olmadığına bakılmaksızın tespit edilebilir olduğunu ya da bir av. Bu davranış gözlemledik ileri geri çalışma zaman, bağlayıcı sonradan yüzeysel plasmon rezonans kullanılarak saflaştınlmış protein bağlayıcı doğrudan doyabilen göstererek spesifik olarak gösterilmiştir. Bizim yapay yem proteinleri pentamerising tarafından bağlanma isteğini artırmak, çünkü biz nicelik etkileşim gücünü karşılaştırmak için uygun tahlil düşünmüyoruz olduğu vurgulanmalıdır. Biz monomerik proteinler ve yüzey plazmon rezonans kullanmak etkileşimlerin biyofiziksel bağlama parametrelerini elde etmek. Son olarak, bir kez bir etkileşim tespit edilmiştir, hitestin gh throughput doğası, antikorlar veya etkileşimi engellemek küçük moleküller gibi reaktifler için ekrana test uyum nispeten kolay hale getirir.
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma Wellcome Trust hibe sayısı [077.108] tarafından desteklenmiştir GJW verilir.
Name of reagent | Company | Cat. Number | Comments |
Freestyle media | Invitrogen | 12338018 | |
Nitrocefin | Calbiochem | 484400 | |
SA-coated microtitre plates | Nunc | 734-1284 | |
OX68 antibody | AbDSerotec | MCA1022R | |
Dialysis tubing | Pierce | PN68100 | |
Polymyxin B | Sigma | P4932 | |
D-biotin | Sigma | B4639-5G | |
Substrate-104 | Sigma | 1040-506 | |
Vivaspin-20 centrifugal concentrators | Sartorius | VS2002 | |
0.22 μm filters | Nalgene | 190-2520 |