Isotachophoresis (ITP) is een robuuste elektrokinetische scheiding en preconcentratiestap techniek met toepassingen variërend van toxine detectie tot monstervoorbereiding. Wij beoordelen de fysische principes van ITP en de methodologie van het toepassen van deze techniek om twee specifieke voorbeeld toepassingen: scheiding en detectie van kleine moleculen en zuivering van nucleïnezuren uit celkweek lysaat.
Elektrokinetische technieken zijn een hoofdbestanddeel van microschaal toepassingen omwille van hun unieke mogelijkheid om een verscheidenheid van vloeibare en elektroforetische processen uit te voeren in eenvoudige, compacte systemen zonder bewegende delen. Isotachophoresis (ITP) is een eenvoudige en zeer robuuste elektrokinetische techniek die miljoen-voudige preconcentratiestap 1,2 en efficiënte scheiding en de winning op basis van ionische mobiliteit kan bereiken. 3 bijvoorbeeld, hebben we de toepassing van het ITP aangetoond dat scheiding en gevoelige detectie van niet-gemerkte ionische moleculen (bijvoorbeeld toxinen, DNA, rRNA, miRNA) met weinig of geen monstervoorbereiding 4-8 en de extractie en zuivering van nucleïnezuren uit complexe matrices met celkweek, urine en bloed. 9-12
ITP bereikt richten en af te scheiden met behulp van een aangelegd elektrisch veld en twee buffers binnen een vloeibare kanaals systeem. Voor anionogene analyten wordt de eerste elektrolyt (LE) buffer gekozen such dat de anionen groter effectief elektroforetische mobiliteit dan de anionen van de achterrand elektrolyt (TE) buffer (effectieve mobiliteit beschrijft waarneembare driftsnelheid van een ion en houdt rekening met de ionisatie stand van de ion, zoals beschreven door Persat et al. hebben 13.). Na de oprichting van een interface tussen de TE en LE, wordt een elektrisch veld toegepast, zodanig dat LE ionen bewegen weg van de streek bezet door TE-ionen. Voorbeeld ionen van intermediaire effectieve mobiliteit ras vooruit TE ionen, maar kan niet inhalen LE-ionen, en daarom ligt de focus op de LE-TE-interface (hierna te noemen de "ITP interface"). Verder, de TE-LE vorm gebieden van respectievelijk lage en hoge geleidbaarheid, dat een steile gradiënt elektrisch veld in het raakvlak ITP stellen. Dit veld gradiënt preconcentrates monster soorten richten zij. Een goede keuze van TE en LE de resultaten in het richten en zuivering van de doelsoorten van andere niet-gerichte soorten en, uiteindelijk, de scheiding eend scheiding van het monster soorten.
Wij hier herziening van de fysische principes die ten grondslag liggen ITP en bespreken twee standaard modi: "piek" en "plateau" modi. In de top-modus, relatief verdunde monster ionen samen richten zich binnen overlappende smalle pieken op de ITP-interface. In plateau mode, meer overvloedig monster ionen bereiken een steady-state concentratie en te scheiden in de aangrenzende plateau-achtige gebieden in volgorde van de effectieve mobiliteit. Peak en plateau vormen komen voort uit dezelfde onderliggende fysica, maar vertegenwoordigen verschillende regimes van elkaar onderscheiden door de eerste analyt concentratie en / of de hoeveelheid tijd uitgetrokken voor de sample accumulatie.
We beschrijven eerst in detail een model piek modus experiment en vervolgens aan te tonen een piek modus test voor de extractie van nucleïnezuren van E. coli cel cultuur. We sluiten af met de presentatie van een plateau-modus test, waar we gebruik van een niet-gericht tracer (NFT) soorten om de scheiding te visualiseren en pervormen kwantificering van aminozuren.
Het ITP methoden hier gepresenteerde snelle, gevoelige en robuuste detectie en behandeling van ionische moleculen. De belangrijkste uitdaging in het gebruik van ITP is een goede keuze van LE en TE buffers. In anionogene ITP wij meestal kiezen chloride als belangrijkste anion omdat het een sterk zuur met een hoge absolute mobiliteit en dus zeer voorspelbare eigenschappen. Daarom wordt buffer keuze anionogene ITP typisch beperkt tot het kiezen van een goede TE en tegenion. Voor selectieve focus experimenten, TE keuze is van cruciaal belang voor uitsluiting van verontreinigende ionen. In toepassingen waar de verontreinigingen niet aanwezig zijn, de lagere TE effectieve mobiliteit leidt tot een sneller tempo van zich te concentreren. Wij raden u aan de volgende, relatief anionische TE-ionen die zich goed gedragen: MES, MOPS, HEPES, tricine. Keuze van tegenion heeft invloed op zowel het systeem pH en TE effectieve mobiliteit. Vaak tegenionen tris (pKa 8.1) en bis-tris (pKa 6.4). Voor de testen die lager of hoger pH, raden wij u pyridine (pKa 5,25) enethanolamine (pKa 9.5), respectievelijk. In de tabellen 1 en 2 voor anionische en kationische ITP respectievelijk vatten we een aantal nuttige buffer voorbeelden. Wij HCl als anionische LE ion en natrium als kationische LE ion, en we nemen 100 mM ionensterkte van de LE buffer.
De lezer zal opmerken dat buffer ionensterkte in protocollen (en in de tabellen 1-2) is altijd groter dan of gelijk aan 10 mM. Hoewel het in theorie de fysica van ITP is van toepassing op ionsterkte lager dan 10 mm, natuurlijke stoffen (bv koolzuur uit reactie tussen water en atmosferische kooldioxide) in de buurt van de 1 mm niveau is vaak beperkt het praktische gebruik van lage ionsterkte buffers.
Wij merken op dat signaaltransductie mechanisme niet beperkt tot de assays in dit protocol. Zoals kort besproken in deel 5, in de plateau-modus gezuiverde zones kunnen worden gedetecteerd via veranderingen in de lokale geleidbaarheid, UV-absorberendeBance, temperatuur of brekingsindex. In onze eigen groep, hebben we een methode ontwikkeld waarbij fluorescerende drager amfolyten maakt gebruik van voor de gevoelige detectie en identificatie van onbekende analyten. 5 piek modus experimenten, specifieke probes kunnen worden gebruikt om gericht analyten te labelen. In een voorbeeld maken we gebruik van moleculair beacons – oligonucleotide probes die bij hybridisatie fluoresceren om hun doelsequentie – om doel-DNA of RNA-moleculen te detecteren met een hoge specificiteit 11,18.
Hoewel ITP relatief robuust dispersie door drukgedreven stroom en EOF, overmatige EOF kan leiden tot stagnatie van de ITP interface, waarbij de gemiddelde snelheid EOF gelijk wordt aan de ITP snelheid 14. Deze sterke EOF komt vooral bij een hoge pH en lage ionensterkte. Om deze reden adviseren wij het gebruik van buffers met pH 8 of lager en met ionische sterkte op de orde van 100 mm als handig. Onze ervaring is dat PVP is demeest effectieve coating EOF onderdrukking in borosilicaat chips. Vanwege de zeven eigenschappen kunnen PVP niet geschikt voor sommige toepassingen, zoals scherpstelling genomisch DNA. In experimenten, zien we dat de toevoeging van PVP kan sterk genomisch DNA absolute bewegingsvrijheid te beperken (tot het punt waar het niet focussen). In deze gevallen silanol bekleding zoals Sigmacote in samenwerking met een oppervlakteactieve stof (bijvoorbeeld Triton-X 100) kan ook effectief in het verminderen EOF 10.
TE anion (pKa -1) | ||||
Buffer tegenion (pKa +1) | MES (6.10) | MOPS (7.20) | HEPES (7,50) | tricine (8.15) |
ethanolamine (9.50) | 21,41 | 20,40 | 17,38 | 22,85 |
tris (8,08) | 21,00 | 19,23 </ Td> | 15,84 | 17,56 |
bis-tris (6.40) | 18,22 | 10,41 | 7,30 | 5,23 |
pyridine (5.18) | 1,01 | 3,72 | 2,42 | 1,48 |
Tabel 1. Effectieve mobiliteit grootte (× 10 -9 m 2 / V / s) van de gecorrigeerde pure analyt zone in anionische ITP waar de LE is 100 mM HCl en 200 mM buffering tegenion.
TE kation (pKa +1) | ||||
Buffer tegenion (pKa -1) | ethanolamine (9.50) | tris (8,08) | bis-tris (6.40) | pyridine (5.18) |
MES (6.10) | 35,57 | 21,96 | 16,39 | 10,45 |
MOPS (7.20) | 35,47 | 20,92 | 9,76 | 3,93 |
HEPES (7,50) | 35,35 | 19,97 | 7,77 | 2,88 |
Tricine (8.15) | 34,77 | 16,72 | 4,50 | 1,44 |
Tabel 2. Effectieve mobiliteit grootte (× 10 -9 m 2 / V / s) van de gecorrigeerde pure analyt zone in kationische ITP waar de LE is 100 mM natrium en 200 mM buffering tegenion.
The authors have nothing to disclose.
We dankbaar erkennen financiering van DARPA gesponsorde Micro / nanofluïdica Fundamentals Focus (MF3) Center onder contract nummer N66001-10-1-4003, en van DARPA subsidie N660001-09-C-2082.
REAGENTS | |||
Name | Company | Catalogue number | Comments |
Distilled water | GIBCO | 10977 | RNase/DNase free |
Clorox Ultra | Clorox | 02489CT | |
sodium hydroxide (NaOH) | Mallinckrodt | 7708 | |
hydrochloric acid (HCl) | EMD Chemicals | HX0603-4 | |
Trizma base (tris) | Sigma-Aldrich | T6066 | |
polyvinylpyrrolidone (PVP) | Polysciences Inc. | 06067 | MW 1,000,000 |
HEPES | Sigma-Aldrich | H-4034 | |
Alexa Fluor 488 carboxylic acid | Invitrogen | A20000 | |
tricine | Sigma-Aldrich | T-9784 | |
bis-tris | Sigma-Aldrich | B4429 | |
EDTA | GIBCO | AM9260G | |
Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | |
SYBR Green II | Invitrogen | S7564 | |
ethanolamine | Sigma-Aldrich | 411000 | |
Rhodamine 6G | Acros Organics (Geel, Belgium) | CAS 989-38-8 | |
L-Amino Acids | Sigma-Aldrich | LAA21 | |
Power SYBR Green RNA-to-CT 1-Step Kit | Applied Biosystems | 4389986 | |
PCR primers | Integrated DNA Technologies | ||
EQUIPMENT | |||
Name | Company | Catalogue number | Comments |
Borosilicate microfluidic chip | Caliper Life Sciences Inc. | NS12A | Supplied with or without plastic caddy |
Vacuum pump | Gast | DOA-P104-AA | |
Sourcemeter | Keithley | 2410 | Constant current and constant voltage operation modes |
Inverted epifluorescent microscope | Olympus | IX70 | Use mercury lamp (Olympus) or LED (Thorlabs) for illumination |
Filter cube | Omega | XF115-2 | Excitation/emission: blue/green |
Safe-lock microcentrifuge tubes | Eppendorf | 022363204 | 1.5 mL capacity |
Centrifuge | Eppendorf | 5417C |
Table 3. Specific reagents and equipment.