Summary
هذا الفيديو يشرح بروتوكول تطبيق صبغة الفلورسنت استر succinimidyl carboxyfluorescein (CFSE) لتحديد وفصل السكان الفرعية المختلفة من الخلايا في ورم أرومي دبقي الإنسان على أساس تواتر انقسام الخلايا.
Abstract
عدم التجانس الورم يمثل سمة أساسية دعم متانة الورم ويشكل عائقا أساسيا في وضع استراتيجيات علاجية 1. للتغلب على مسألة عدم التجانس الورم، فمن الضروري لتطوير المقايسات وأدوات تمكينية المظهري، (EPI) تحديد الوراثية والوظيفية وتوصيف المجموعات السكانية الفرعية التي تدفع الأمراض السرطانية مرض محدد، وتمثل الأهداف ذات الصلة سريريا. والآن راسخة أن الأورام تظهر متميزة الفرعية كسور الخلايا مع ترددات مختلفة من انقسام الخلايا، والذي يرتبط بشكل إيجابي على معايير وظيفية يجري الدراجات بطيئة مع القدرة تشكيل الورم في سرطان عدة بما في ذلك الدماغ والجلد والثدي و البنكرياس وكذلك سرطان الدم 2-8. تم استخدام صبغة الفلورسنت carboxyfluorescein succinimidyl استر (CFSE) لتتبع وتيرة انقسام الخلايا في المختبر والمجراة في الدم المنقولة رumors والأورام الصلبة مثل ورم أرومي دبقي 2،7،8. يتم تحويل الخلايا نفيذ غير الفلورسنت المؤيدة لتعاطي المخدرات من قبل CFSE الاسترات داخل الخلايا إلى مجمع الفلورسنت، والتي يتم الاحتفاظ داخل الخلايا بواسطة ملزمة تساهميا إلى البروتينات من خلال رد فعل شاردة في succinimidyl مع مجموعات أمين الخلايا لتشكيل السندات مستقرة أميد 9. موزعة بالتساوي بين صبغة الفلورسنت الخلايا الوليدة على الانقسامات، مما أدى إلى بمقدار النصف من شدة التألق مع كل انقسام الخلية. وهذا يتيح تتبع دورة الخلية تردد تصل إلى 8-10 جولات من تقسيم 10. وقد استخدم CFSE القدرة على الاحتفاظ بخلايا ورم في المخ لتحديد وعزل جزء من السكان الدراجات بطيئة (أعلى 5٪ صبغ الاحتفاظ الخلايا) أظهرت لتخصيبه في نشاط الخلايا الجذعية السرطانية 2.
يصف هذا البروتوكول أسلوب تلطيخ الخلايا مع CFSE وعزل السكان الفردية ضمن ثقافة الإنسان الدبقأرومي (GBM) الخلايا المشتقة امتلاك معدلات مختلفة باستخدام تقسيم التدفق الخلوي 2. وقد خدم هذه التقنية لتحديد وعزل ورم دماغي بطيء الدراجات السكان من الخلايا بحكم قدرتها على الإبقاء على وضع العلامات CFSE.
Protocol
1. إعداد تعليق خلية واحدة ورم أرومي دبقي
- تم تأسيس Gliomasphere الثقافة والمحافظة باستخدام مقايسة neurosphere (NSA) والتي سبق وصفها 2،11،12.
- في الوقت المناسب لالركض وgliomaspheres، تتم إزالة المتوسطة التي تحتوي على مجالات، وضعت في حجم الأنسجة المعقمة المناسبة أنبوب الثقافة، وطرد في 800 دورة في الدقيقة (110 غ) لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- يتم تجاهل طاف وبيليه معلق من المجالات في 1 مل من التربسين 0.05٪، وحضنت EDTA عند 37 درجة مئوية في حمام مائي لمدة 3-5 دقيقة.
- ثم يتم استخدام حجم مساو من التربسين المانع فول الصويا لوقف النشاط التربسين.
- وpipetted بلطف التعليق الخلية صعودا وهبوطا لضمان التجانس وتحييد الكامل للنشاط التربسين.
- مرة أخرى يتم طرد تعليق الخلية في 800 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق. تتم إزالة طاف ومعلق الخلايا في 1ml من NeuroCultNSC متوسطة القاعدية.
- يتم خلط 10μl من التعليق وحيدة الخلية مع 90μl من اللون الأزرق التريبان لتنفيذ عدد خلايا.
2. تلطيخ مع الخلية تتبع استر Succinimidyl Carboxyfluorescein (CFSE) صبغة الفلورسنت الأخضر
- لكل الخلايا 1 مليون دولار لتكون الملون، ويتم إعداد 1 مل من كاشف تلطيخ بإضافة 1 ميكرولتر من 5 ملم صبغة خلية تتبع CFSE (مجسات الجزيئية، إينفيتروجن) إلى 1 مل من متوسطة NSC NeuroCult بصل لإعطاء تركيز تلطيخ النهائية من 5 ميكرومتر .
- يتم خلط الكاشف تلطيخ الخلايا التي تحتوي على ما يرام حتى التجانس وحضنت في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة.
- خلال الحضانة، ويتم إعداد الجليد الباردة متوسطة NSC NeuroCult بصل كحل التبريد.
- لإيقاف عملية تلوين، يتم إضافة كميات من حل بحوالي 5-10 التبريد الجليد الباردة إلى الخلايا CFSE محملة.
- ثم يتم طرد الحل في 800 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق ويتم تجاهل طاف.
- في الهو النقطة، يجب أن تظهر هناك لبيليه من الخلايا في أسفل الأنبوب مع لون مشرق الخضراء اللون، مما يدل على تلطيخ كانت ناجحة.
- تغسل الخلايا عن طريق resuspending بيليه في 1-2 مل من جديد متوسطة NSC NeuroCult بصل، الطرد المركزي في 800 دورة في الدقيقة لطاف ال 5 دقائق والتخلص. ويتكرر هذا الإجراء ما مجموعه ثلاثة يغسل.
- بعد غسل الثالث، ومعلق الخلايا في 1 مل من متوسطة NSC NeuroCult بصل ويتم تنفيذ عدد خلايا.
- ومطلي الخلايا ثم CFSE الملون في قوارير معقمة زراعة الأنسجة في كثافة مناسبة [50000 خلية / مل] وضعت في الحاضنة 37 درجة C / مرطب 5٪ CO2.
3. تحميل CFSE التحقق
- يمكن رصد الخلايا في الثقافة مطلي NSA تحت المجهر الفلورسنت للتحقق من تلطيخ CFSE. في هذه المرحلة، كافة الخلايا تظهر اللون الأخضر الساطع (الشكل 1). بدلا من ذلك، قطرة من تعليق خلية منيمكن وضع الخلايا الملون CFSE على شريحة المجهر وساترة مغطاة لتصور الخلايا تحت المجهر الفلورسنت.
- ويؤكد كذلك وضع العلامات الناجحة CFSE عبر التدفق الخلوي. ما يصل إلى 1-5 × 10 5 خلايا من كل مجموعة كافية للتحقق تلطيخ CFSE. وCFSE تحميل وتفريغ معلق الخلايا والخلايا السيطرة السلبية على التوالي في 1 X-PBS أو NeuroCult NSC متوسطة بصل لإجمالي حجم 500 ميكرولتر ووضعها في أنابيب FACS منفصلة.
- يتم ضبط قياس التدفق الخلوي بناء على تعليمات من دليل المستخدم للمعايير ذات الصلة. CFSE لديه الحد الأقصى الطول الموجي الإثارة من 492 نانومتر والحد الأقصى من 517 نانومتر الانبعاثات.
- أولا، يتم تشغيل خلايا التحكم تفريغ ويتم تسجيل أحداث حصلت في مبعثر إلى الأمام والجانب (FSC مقابل SSC) الرسم البياني والمخططات، والسكان الخلية الرئيسية هي بوابات (الشكل 2A).
- وبالمثل، يتم تحليل الخلايا CFSE تحميل باستخدام المعلمة نفسق المستخدمة لخلايا التحكم (الشكل 2B).
4. عزل بطيئة تقسيم [CFSE أي الإبقاء] السكان الخلية باستخدام نيون الفرز الخلية المنشط (FACS)
- على التقسيم، وانخفضت كثافة CFSE والخلايا hGBM تشكيل gliomaspheres التي تتكون من الخلايا العارضة مستويات مختلفة من الكثافة مضان أخضر (الشكل 3). عندما وصلت الى gliomaspheres متوسط حجم ما يقرب من 150-200 ميكرون في القطر (ما يقرب من 5 إلى 10 أيام آخر تحميل CFSE اعتمادا على معدل النمو خلية الخط)، تتم إزالة المتوسطة التي تحتوي على مجالات، وضعت في ثقافة حجم الأنسجة المعقمة المناسبة أنبوب، وطرد في 800 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- ويتم إعداد تعليق خلية واحدة كما هو موضح في الخطوات السابقة ومعلق الخلايا في برنامج تلفزيوني لعدد خلايا من أجل إعداد تعليق خلية ذات الكثافة تصل إلى 10 7 خلية لكل مليلتر.
- الخلفإيه resuspending الخلايا في حجم مناسب لPBS، يضاف يوديد Propidium (PI، سيغما، 500 ميكروغرام / مل) عند تركيز من 1 ميكرولتر / مل من تعليق خلية لاستبعاد الخلايا الميتة عندما يتم فرزها / تحليلها من قبل التدفق الخلوي.
- يتم استخدام اثنين 15 مل العقيمة زراعة الأنسجة التي تحتوي على أنابيب 1ML كل من اكتمال متوسطة NSC NeuroCult لجمع الخلايا مصنفة بطيئة تقسيم (خلايا CFSE الاحتفاظ) والخلايا سريعة الانقسام (خلايا CFSE تمييع).
- أولا، يتم تشغيل الخلية تعليق من مجموعة الخلايا المفرغة من خلال تدفق عداد الكريات.
- يتم رسم الخلايا (الأحداث) على أساس مبعثر إلى الأمام (FSC) مقابل الجانب مبعثر (SSC) والمعلمات على حد سواء الجهد المعلمات تم تعديل بحيث يتم تضمين معظم الخلايا في مؤامرة التدفق.
- استبعاد الخلايا الميتة أو المتضررة، يتم رسم الخلايا يعتمد على SSC مقابل PI تفاعل واحدة الخلية الحية السكان (PI سلبي). بوابات.
- ثم، يتم تحديد عدد السكان خلية متجانسة على أساس Fمبعثر orward (FSC) مقابل الجانب مبعثر (SSC).
- يتم رسم ثم متجانسة واحدة الخلية الحية السكان في الرسم البياني يعتمد على تردد الخلية مقابل كثافة CFSE تعيين على مقياس لوغاريتمي. يتم ضبط كثافة الليزر CFSE من أجل وضع إشارة سلبية بين 0 و 100.
- باستخدام نفس المعلمات واستراتيجية النابضة مماثلة، يتم تشغيل خلايا CFSE المسمى من خلال تدفق عداد الكريات وتحليلها (4C الشكل).
- وبعد ذلك، يتم تحديد عدد السكان بطيئا تقسيم الخلايا وإجمالي عدد السكان (أسرع تقسيم الخلايا) على أساس قدرتها على الاحتفاظ CFSE (CFSE عالية أعلى 5٪ وCFSE المنخفضة أسفل٪ 85، على التوالي).
- ثم يتم تصنيف هؤلاء السكان مختلفة من الخلايا في 15 مل العقيمة منفصلة أنابيب زراعة الأنسجة التي تحتوي على 1ml من المتوسطة NSC كاملة.
- وطرد الخلايا ثم تم الفرز في 800 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق.
- يتم تجاهل طاف وبيليه معلق في APPROيتم تنفيذ حجم priate المتوسطة (اعتمادا على عدد من الأحداث المعزولة أو حجم بيليه)، وعدد خلايا.
- ومطلي ثم الخلايا من مجموعات سكانية مختلفة مصنفة في 50،000 الخلايا في المليلتر في مناسبة معقمة الأنسجة قارورة الثقافة وضعت في الحاضنة 37 درجة CO2 C / مرطب 5٪ لمدة 5-10 أيام قبل أن يتم passaged متسلسل أو استخدامها لتجارب المصب.
5. ممثل النتائج
بعد تحميل CFSE، وجميع الخلايا يقدم مضان مكثفة الأخضر تصور تحت المجهر (الشكل 1). ويمكن رؤية هذا اللون الأخضر ملون حتى بالعين المجردة (انظر الفيديو). تحليل هذه الخلايا مع التدفق الخلوي يظهر أيضا مضان أخضر مكثفة للغاية مقارنة مع الخلايا السيطرة (الشكل 2). على الخلايا CFSE الطلاء الذي تم تحميله في الثقافة neurosphere، تتكاثر هذه الخلايا وتشكيل 150-200 ميكرون gliomaspheres في 5-10 أيام. كما تتكاثر الخلايا، ر موزعة بالتساوي بين انه صبغة الفلورسنت الخلايا الوليدة على الانقسامات، مما أدى إلى بمقدار النصف من شدة التألق مع كل انقسام الخلية. غير متجانسة وظيفيا Glioblastomas وتتكون من الخلايا المتكاثرة على نطاقات زمنية مختلفة. الطريقة الموضحة في هذا البروتوكول تمكن واحد لتحديد وعزل الخلايا السريعة والبطيئة تقسيم بحكم قدرتها على تمييع أو الاحتفاظ CFSE على التوالي (الشكل 3، انظر أيضا الفيديو).
تحليل التدفق الخلوي من gliomaspheres فصل المولدة من الخلايا CFSE محملة بالمقارنة مع الخلايا تفريغ يوضح خصائص متنوعة الاحتفاظ CFSE (الشكل 4). تقسيم الخلايا بسرعة (أسفل 85٪) أو بطيئة تقسيم الخلايا (أعلى 5٪ - CFSE عالية) gliomapshere معرض تشكيل القدرة عند تربيتها في ظروف الفحص neurosphere (الشكل 5).
جوري 1 "/>
الشكل 1. فصل الخلايا السرطانية مباشرة بعد التحميل مع صبغة CFSE. الخلايا يحمل اللون الأخضر يدل مشرق وضع العلامات الناجحة. التكبير الأصلية؛ 10 ×.
الشكل 2. CFSE تأكيد التحميل باستخدام التدفق الخلوي. A) خلايا المفرغة، B) تحميل CFSE الخلايا وC) مقارنة كثافة مضان CFSE في الخلايا المحملة مقابل تفريغ. لاحظ أن هناك عدة أوامر من حجم الاختلاف في كثافة مضان بين الخلايا وصفت والخالي من الملصقات.
الشكل 3. A gliomasphere ممثل المستمدة من خلية CFSE محملة 6 أيام بعد الطلاء. بعض الخلايا تظهر مشرقة جدا تلطيخ CFSE. التكبير الأصلية؛ 63 ×.
gliomaspheres الممثل الشكل 5. المتولدة من
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد أظهرت عددا متزايدا من الدراسات على أهمية وجود حجرة الفرعية بطيئة تقسيم الخلايا في سرطان التي تسهم في تشكيل الورم والعلاج المقاومة 2-8. ولذلك فمن الأهمية بمكان لوصف وتوحيد الطرق التجريبية تمكن دراسة هذه حيوانية معينة من الخلايا أو أكثر لمقارنة مجموعات سكانية فرعية عموما مع معدلات النمو المختلفة. باستخدام CFSE لتحديد وعزل أجزاء من شبه الخلايا يعتمد على معدل انقسام الخلايا هو نقطة انطلاق لتعزيز وصفها لهذه الكسور محددة الخلوية، مما يساعد على تعزيز فهمنا لعدم التجانس وصفها في الأورام. في هذا البروتوكول أعطينا المثال تحديد وعزل السكان بطيئة تقسيم داخل ورم أرومي دبقي، ولكن يمكن أيضا أن تطبق هذا البروتوكول إلى الخلايا السرطانية الأخرى، بما في ذلك وليس على سبيل الحصر سرطانات الثدي والبنكرياس والجلد. ويمكن إجراء التحليل المصب من هؤلاء السكان ويمكن أن تشمل functIONAL الدراسات التي تقارن إمكانات التكاثري 2، الورم القدرة تشكيل 2، الحساسية العلاج، و(EPI) المقارنات الجينية. ويمكن أيضا أن تستخدم هذه المنهجية مع أنظمة غير سرطانية ويمكن تطبيقها، على سبيل المثال، لوقف جسدية / خلايا السلائف.
النقاط الفنية الهامة ضمن الإجراء المعنية التفكك كافية من الخلايا مع التربسين، وإعادة تعليق كاف من الخلايا في وسائل الإعلام تلطيخ لإنشاء الكثافة المناسبة وضمان تلطيخ متجانسة. يجب أن يتم التحقق عينة صغيرة من خلايا طازجة الملون بواسطة التدفق الخلوي لضمان وضع العلامات متجانسة تتميز الملف الشخصي التمويه مثل ضيقة (انظر الشكل 2B). في حالة وضع العلامات الأولية غير المتجانسة، يمكن تنفيذ ما قبل الفرز من أجل تحسين القرار الذروة مع أضيق نطاق مضان CFSE. ومع ذلك يجب أن يتم التأكد من أن هذا النوع قبل لا حدد لأحجام محددة. استخدام يوديد propidium (PI) وضع العلامات هو أناmportant لتحديد الخلايا الحية والميتة لإزالة السكان / التالفة من بوابة العمل، وذلك بسبب التحيز الذي يمكن أن يعرض الخلايا الميتة في تطبيقات المصب. تجدر الإشارة إلى كثافة عالية مضان ولا سيما من وضع العلامات CFSE وقدرتها على تنزف في القنوات الأخرى عند استخدام fluorochromes المجاورة في الطيف، مثل فيكوإيريترين ملون تألقي (PE). من الأهمية بمكان أن نلاحظ أن التجارب وضع العلامات متعددة مع CFSE والأجسام المضادة ملون تألقي، مترافق قد تتطلب عملية التعويض في الوقت اقتناء أو التحليل. تأكد من الحصول على جميع الضوابط اللازمة التي تشمل خلايا غير ملوثين (توفير مستوى تألق ذاتي)، وخلايا منفردة الملون والجمع المحددة الخاصة بك. وضع العلامات المتعددة الألوان في مزيج مع CFSE يعمل بشكل أفضل مع fluorochromes مثل الأزرق أو Allophycocyanin المحيط الهادئ (APC). إذا كان الغرض من التجربة هو تحديد العدد المطلق للانقسامات الخلية على مدى فترة محددة من الزمن، وCFSE متوسط كثافة مضان (MFI) لابد من قياس على الأقل اثنين من نقطة 2 زمنية مختلفة مع أول واحد لا يقل عن 24 ساعة CFSE آخر تحميل. كثافة CFSE انخفاض كبير في غضون ال 24 ساعة الأولى في ظل غياب انقسام الخلايا ولكن يستقر ثم والنقصان فيما يتعلق انقسام الخلايا. من الضروري أيضا لتشمل السيطرة مع الخلايا غير التكاثري CFSE تحميل توفير الأساس لتسوس كثافة CFSE لا علاقة لها انقسام الخلايا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل مركز فلوريدا لأبحاث استئصال ورم من الدماغ، وA. بريستون ويلز الابن مركز للعلاج استئصال ورم من الدماغ والمعاهد الوطنية للصحة (1R21CA141020-01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NeuroCult NSC Basal Medium (Human) | Stem Cell Technologies | 05750 | |
| NeuroCult NSC Proliferation Supplements (Human) | Stem Cell Technologies | 05753 | |
| %0.05 trypsin-EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 25300-062 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Sigma-Aldrich | T6522 | |
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| T25 flask | Nalge Nunc international | 136196 | |
| T80 flask | Nalge Nunc international | 178905 | |
| 15 ml tubes | BD Biosciences | 352096 | |
| 50 ml tubes | BD Biosciences | 352070 | |
| EGF | R&D Systems | 2028-EG | |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Molecular Probes, Life Technologies | C34554 |
References
- Tian, T., Olson, S., Whitacre, J. M., Harding, A. The origins of cancer robustness and evolvability. Integr. Biol. (Camb). 3, 17-30 (2011).
- Deleyrolle, L. P. Evidence for label-retaining tumour-initiating cells in human glioblastoma. Brain. 134 (Pt. 5), 1331-1343 (2011).
- Krishnamurthy, K., Wang, G., Rokhfeld, D., Bieberich, E. Deoxycholate promotes survival of breast cancer cells by reducing the level of pro-apoptotic ceramide. Breast Cancer Res. 10, 106-106 (2008).
- Pece, S. Biological and molecular heterogeneity of breast cancers correlates with their cancer stem cell content. Cell. 140, 62-73 (2010).
- Roesch, A. A temporarily distinct subpopulation of slow-cycling melanoma cells is required for continuous tumor growth. Cell. 141, 583-594 (2010).
- Dembinski, J. L., Krauss, S. Characterization and functional analysis of a slow cycling stem cell-like subpopulation in pancreas adenocarcinoma. Clin. Exp. Metastasis. 26, 611-623 (2009).
- Graham, S. M. Primitive, quiescent, Philadelphia-positive stem cells from patients with chronic myeloid leukemia are insensitive to STI571 in vitro. Blood. 99, 319-325 (2002).
- Holyoake, T. L. Primitive quiescent leukemic cells from patients with chronic myeloid leukemia spontaneously initiate factor-independent growth in vitro in association with up-regulation of expression of interleukin-3. Blood. 97, 720-728 (2001).
- Parish, C. R. Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies. Immunol. Cell Biol. 77, 499-508 (1999).
- Lyons, A. B. Analysing cell division in vivo and in vitro using flow cytometric measurement of CFSE dye dilution. J. Immunol. Methods. 243, 147-154 (2000).
- Azari, H. Isolation and Expansion of Human Glioblastoma Multiforme Tumor Cells Using the Neurosphere Assay. J. Vis. Exp. (56), e3633-e3633 (2011).
- Azari, H. Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay. J. Vis. Exp. (45), e2393-e2393 (2010).
