Un fluorescencia<em> In situ</emLa hibridación> (FISH) método fue desarrollado para detectar visualmente ARN genómico del virus utilizando microscopía de fluorescencia. Una sonda se hace con especificidad para el ARN viral que luego pueden ser identificados utilizando una combinación de hibridación y técnicas de inmunofluorescencia. Esta técnica ofrece la ventaja de identificar la localización del ARN viral o ADN en estado estacionario, el suministro de información sobre el control de eventos intracelulares de virus trata de personas.
Los virus que infectan a las células provocan cambios específicos en las funciones celulares normales que sirven para desviar la energía y los recursos para la replicación viral. Muchos aspectos de la función de la célula huésped se comandado por virus, por lo general por la expresión de productos génicos virales que reclutan proteínas de la célula huésped y maquinarias. Por otra parte, los virus orgánulos de membrana específicos de ingeniería o una etiqueta en que las vesículas celulares y las proteínas motoras para apuntar las regiones de la célula (durante la infección de novo, virus cooptar las proteínas motoras moleculares para atacar el núcleo, más tarde, durante el ensamblaje del virus, se secuestran celulares mecanismos que ayuden en el montaje de los virus). Menos aún se entiende sobre cómo los virus, en particular los que tienen genomas de ARN, coordinar el tráfico intracelular de proteínas y componentes de ARN y cómo lograr el montaje de partículas infecciosas en loci específicos en la célula. El estudio de la localización del ARN se inició en el trabajo anterior. El desarrollo de bajos em eucariotasbryos y las células neuronales proporcionan información biológica importante, y también subrayó la importancia de la localización del ARN en la programación de las cascadas de expresión génica. El estudio en otros organismos y sistemas celulares ha generado información importante similar. Los virus son parásitos obligados y deben utilizar sus células huésped para replicarse. Así, es crítico para comprender cómo los virus de ARN dirigir sus genomas de ARN a partir del núcleo, a través del poro nuclear, a través del citoplasma y en uno de sus destinos finales, en partículas de virus progenie 1.
FISH sirve como una herramienta útil para identificar los cambios en el estado de equilibrio de localización del ARN viral. Cuando se combina con inmunofluorescencia (IF) el análisis de 22 de FISH / si los compañeros de análisis proporcionará información sobre la co-localización de las proteínas con el ARN viral 3. Este análisis proporciona por tanto un buen punto de partida para poner a prueba para las interacciones proteína-ARN por bioquímicos o biofísicos4,5, ya que las pruebas de co-localización por sí sola no es suficiente evidencia para estar seguro de una interacción. En el estudio de localización del ARN viral utilizando un método como este, abundante información ha sido obtenida en los dos eventos de tráfico de ARN virales y celulares 6. Por ejemplo, el VIH-1 produce ARN en el núcleo de las células infectadas pero el ARN se traduce sólo en el citoplasma. Cuando una proteína viral clave falta (Ap) 7, FISH del ARN viral, ha revelado que el bloque de la replicación viral se debe a la retención de los VIH-1 RNA genómico en el núcleo 8.
A continuación, presentamos el método para el análisis visual de ARN genómico del virus in situ. El método hace uso de una sonda marcada con ARN. Esta sonda está diseñado para ser complementario al ARN genómico viral. Durante la síntesis in vitro de la sonda de ARN antisentido, la ribonucleótido que se modifica con digoxigenina (DIG) está incluido en un in vitro transcription reacción. Una vez que la sonda ha hibridado con el objetivo de ARNm en las células, las etapas subsiguientes de etiquetado de anticuerpos (Figura 1) revelará la localización del mRNA, así como proteínas de interés cuando se realiza PESCADO / SI.
PESCADO / si los compañeros de análisis es un método confiable para visualizar el ARN viral en las células que ahora se ha ido perfeccionando 9,15,16. En el transcurso de varios años, hemos desarrollado un método perfeccionado de la tinción de ARN. Esta técnica se puede utilizar en una amplia gama de tipos de células siempre que la sonda es específica para la diana de ARN 17. En el etiquetado de la sonda con DIG, somos capaces de visualizar el ARN mediante tinción simple. Cuando la tinción de ARN y las proteínas se combinan otras, FISH / si los compañeros de los análisis de convertirse en una poderosa herramienta para observar las estructuras celulares y localización de la proteína / RNA.
La especificidad de la detección de RNA es bastante alta. Esto se ilustra en la Figura 2. En algunas de la obra original que se centró en la localización del ARN genómico viral, FISH estableció que la falta de Rev atrapado ARN viral en el núcleo 18. Dado esto, la información abundante nuevo en genómica localización del ARN viral se ha obtenido mediante el Technique indica aquí. Por sobreexpresan proteínas celulares, las poblaciones de específicas y no todo-del ARN viral puede ser obligado a localizar a las diferentes regiones de la célula. Sobreexpresión RILP, que se asemeja al fenotipo obtenido cuando hnRNP A2 se agote por siRNA en VIH-1-células que expresan 13, hace que el ARN para acumular visiblemente en el COMT. El RNA genómico viral puede ser empujada a la periferia de la célula mediante la desactivación de la proteína motora menos extremo, dineína: la sobreexpresión p50/Dynamitin o una caída de las cadenas pesadas de dineína 1 da como resultado la liberación de ARN genómico del virus de dominios intracelulares a la periferia celular ( Figura 2). Un mutante de RILP, RILPΔN, que ya no se une el motor dineína, se dispersa endosomas (marcados por LÁMPARA1) en el citoplasma, ya que ya no se activa localizada en dominios juxtanuclear. Estos resultados apuntan a la noción de una población de plástico de VIH-1 RNA genómico y, en particular, de que grupos diferentes de VIH-1 genómicoARN existen con roles a veces identificables en el ciclo de replicación viral. Estas mismas ideas ya han sido identificados para la proteína codificada por este ARNm, Gag 19.
Existen limitaciones en los usos de FISH / si los compañeros de los análisis que están relacionados con la elección de anticuerpos y disponibilidad. La optimización de la mejor combinación de anticuerpos primarios y secundarios, y sus concentraciones, se necesitará tiempo para optimizar (ver Tabla 1 y 2). Anticuerpos producidos a partir de hibridomas o producidos por las grandes empresas pueden tener concentraciones que varían según el lugar de 1:2 a 1:2000, pero asegúrese de seguir las directrices proporcionadas por el fabricante para obtener mejores resultados. El huésped en la que se produce el anticuerpo también debe tomarse en consideración. Ovejas de mezcla con anticuerpos de cabra también se debe evitar en anticuerpos primarios y secundarios en esta combinación resulta en un fondo elevado debido a la cruzada de especies de reconocimiento (datos no mostrados). Para Alexa-Fluor secondary anticuerpos, la concentración puede ser utilizado en 1:500 para casi cualquier anticuerpo en el conjunto. El otro inconveniente con FISH / si los compañeros de análisis como se describe en este informe es que captura el ARN en su ubicación en el estado estacionario, después que las células han sido fijados con paraformaldehído y permeabilized y detergente (figura 1).
Sin embargo, el ARN de imágenes en células vivas que se ha logrado a través de una variedad de medios de 20 a 22, en su mayoría utilizando variaciones de genomas virales de ARN que son marcadas por las proteínas fluorescentes, tales como las buenas prácticas agrarias. Sin embargo, medios adicionales para identificar la localización del ARN en células vivas siguen a la superficie. Estos nuevos métodos implican el ARN marcado por medio de la espinaca 23, 24, o SNAP mTrip 2. Estas técnicas también sufren de algunos inconvenientes, incluyendo el requisito para permeabilizar las células antes de la adición de sustratos o un resto que debe ser diseñado para etiquetar el ARNm con el fin de detectar el ARNm por microscopía. De hecho, la mayor Advantage de análisis FISH descritas en este informe reside en el hecho de que el ARN es inalterado nativo que conduce a los resultados más fisiológicamente relevantes.
The authors have nothing to disclose.
Los autores agradecen a los miembros anteriores y actuales del laboratorio para las contribuciones al desarrollo de la metodología descrita aquí y Alan Cochrane para el consejo. LA es un receptor de un Institutos Canadienses de Investigación en Salud (CIHR) Becas de Doctorado y AJM con el apoyo de un premio a la Trayectoria Fraser, Monat y MacPherson. Este trabajo es apoyado por una beca de la CIHR (subvención # RP-56974).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
18mm coverslips | VWR | 48380 046 | |
16% paraformaldehyde | J.T. Baker | S898-07 | To make 4%: Dissolve 20g in 500mL 1XDPBS at 60°C with 5 drops NaOH. pH to 7.2 off the heat and store at -20 °C. Do not exceed 70°C! |
Triton-X | OmniPur | 9400 | |
Micro Elute Gel Extraction Kit | Roche | D6294-02 | |
DIG RNA Labelling Mix | Roche | 11277073910 | |
Transcription T7 RNA Polymerase | Invitrogen | 18033-019 | |
Quick Spin Columns | Roche | 11814427001 | |
DNase I | Invitrogen | 18047-019 | |
1X DPBS | Gibco | 14190-250 | |
Formamide | EMD | FX0420-8 | |
tRNA | Invitrogen | 15401-021 | |
RNase OUT | Invitrogen | 10777-019 | |
Fluorescent Antibody Enhancer Set for DIG Detection #4 (blocking solution) | Roche | 1768506 | |
Alexa Fluor secondary antibodies | Invitrogen | See Table 2 | |
Hybridization Oven | Boekel Scientific | Model 24100 | |
Microslides | VWR | 48300-047 | |
Immunomount | Thermoscientific | 9990402 |
Table 1. Identification of specific reagents and equipment
Species of anti-DIG antibody (dilution; company, catalogue number) | Colours | Alexa Fluor used (1:500) |
Mouse (1:500;Sigma, B7405) | green | Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse (Invitrogen, A21202) |
red | Alexa Fluor 594 donkey anti-mouse (Invitrogen, A21203) | |
blue | Alexa Fluor 647 donkey anti-mouse (Invitrogen, A31571) | |
Sheep (1:200;Roche, 11376623) | green | Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep (Invitrogen, A11015) |
red | Alexa Fluor 594 donkey anti-sheep (Invitrogen, A11016) | |
blue | Alexa Fluor 647 donkey anti-sheep (Invitrogen, A21448) |
Table 2. Combinations of secondary antibodies and anti-DIG listed with catalogue numbers and concentrations.