Caratterizzazione dei meccanismi molecolari di<em> In vivo</em> UVR indotta cataratta
Summary
La cataratta è la principale causa di cecità nel mondo. Radiazione ultravioletta solare (UVR) è il principale fattore di rischio per lo sviluppo della cataratta. Un modello animale di gran lunga raggi UV-B indotta da cataratta è stato sviluppato. In questo articolo si descrivono i metodi di indagine della cataratta: l'esposizione a raggi UV, RT-PCR e immunoistochimica.
Abstract
La cataratta è la principale causa di cecità nel mondo 1. L'Organizzazione Mondiale della Sanità definisce cataratta come una opacità del cristallino dell'occhio che impedisce il trasferimento della luce. La cataratta è una patologia multifattoriale associata al diabete, il fumo, le radiazioni ultraviolette (UVR), alcool, radiazioni ionizzanti, gli steroidi e l'ipertensione. Vi è una forte evidenza sperimentale 2-4 e 5,6 epidemiologica che UVR causa della cataratta. Abbiamo sviluppato un modello animale per UVR B cataratta indotta sia anestetizzati 7 e non animali anestetizzati 8.
L'unica cura per la cataratta è l'intervento chirurgico, ma questo trattamento non è accessibile a tutti. È stato stimato che un ritardo di insorgenza della cataratta per 10 anni potrebbe ridurre la necessità di chirurgia della cataratta del 50% 9. Per ritardare l'incidenza di cataratta, è necessario per comprendere i meccanismi di formazione della cataratta e trovare strategia efficace di prevenzionegie. Tra i meccanismi di sviluppo della cataratta, apoptosi svolge un ruolo cruciale nella apertura di cataratta nell'uomo e negli animali 10. La nostra attenzione è stata recentemente apoptosi nella lente come meccanismo per la cataratta sviluppo 8,11,12. Si prevede che una migliore comprensione dell'effetto della UVR sul percorso apoptosi fornirà possibilità per la scoperta di nuovi farmaci per prevenire la cataratta.
In questo articolo, si descrive come la cataratta può essere indotta sperimentalmente dalla esposizione in vivo a raggi UV-B. Inoltre RT-PCR e immunoistochimica sono presentati come strumenti per lo studio dei meccanismi molecolari di raggi UV-B indotta da cataratta.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo articolo descrive i metodi che consentono di studiare gli eventi molecolari che si verificano durante raggi UV-B indotta da cataratta.
Considerando, che più le informazioni disponibili in vivo UVR cataratta indotta è stato derivato da esperimenti su albino Sprague-Dawley 7, 16, 17, 18, 19, abbiamo deciso di utilizzare l'albino ratto Sprague-Dawley nel presente studio. Età dei ratti aveva sei settimana fa. Il genere è stato scelto per essere femm…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dal Karolinska Institutet KID-finanziamento, Autorità svedese per la protezione dalle radiazioni, Karolinska Institutet Eye Research Foundation, Gun och Bertil Stohnes Stiftelse, Occhio di St. Erik Hospital Research Foundation, Ögonfonden, Konung Gustav V: s och Drottning Viktorias Frimurarstiftelse.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Ketalar | Pfizer | 150086 | 50 mg/ml |
| Rompun | Bayer | 022545 | 20 mg/ml |
| Oculentum Simplex | Apoteket, Sweden | 336164 | 5 g |
| Mydriacyl | Alcon | 00352 | 10 mg/ml |
| Balanced salt solution | Alcon | 0007950055 | |
| 3.5 ul β-mercaptoethanol | |||
| NucleoSpin RNA II total RNA isolation kit | Macherey-Nagel GmbH&Co, Duren, Germany | 740955.50 | |
| p53 DNA specific primers | biomers.net GmbH | Custom made | |
| Taq DNA polymerase, dNTPack | Roche | 04 728 866 001 | |
| Agarose | Sigma | A5093 | |
| Ethidium bromide solution 0.5 mg/ml | Sigma | E1385 | |
| Nano-Drop ND-1000 spectrophotometer | NanoDrop Products | ||
| 1st Strand cDNA synthesis kit for RT-PCR (AMV) | Roche Diagnostics GmbH | 11 483 188 001 | |
| iCycler MyiQ Single Color Real Time PCR detection system | Bio-Rad Laboratories | ||
| 96-well plate | Sarstedt | 72.1979.202 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Applied Biosystems | 4369016 | |
| TaqMan Gene Expression Assay for caspase 3 | Applied Biosystems | Rn00563902_m1 | |
| TaqMan Gene Expression Assay for 18s | Applied Biosystems | Hs99999901_s1 | |
| MyiQ software | Bio-Rad Laboratories | ||
| Cleaved caspase-3 (Asp175) | Cell signaling technology | 9661 | |
| Anti rabbit IgG | Abcam | Ab6798 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | 84097 | |
| Vectashield | Vector Laboratories | ||
| Universal Microscope Axioplan 2 Imaging | Carl Zeiss | ||
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 441244 | |
| TBE buffer 10x | Promega | V4251 |
References
- Brian, G., Taylor, H. R. Cataract blindness: challenge for the 21 st century. Bulletin of the World Health Organization. 79, 249-256 (2001).
- Jose, J. G., Pitts, D. G. Wavelength dependency of cataracts in albino mice following chronic exposure. Experimental Eye Research. 41, 545-563 (1985).
- Söderberg, P. G. Acute cataract in the rat after exposure to radiation in the 300 nm wavelength region. A study of the macro-, micro- and ultrastructure. Acta Ophthalmol. (Copenh). 66, 141-152 (1988).
- Meyer, L., Dong, X., Wegener, A., Söderberg, P. G. Dose dependent cataractogenesis and Maximum Tolerable Dose (MTD 2.3:16) for UVR – B induced cataract in C57BL/6J mice. Experimental Eye Research. 86, 282-289 (2008).
- McCarty, C., et al. Assessment of lifetime ocular exposure to UV-B: the Melbourne visual impairment project. Developments in Ophthalmology. 27, 9-13 (1997).
- Sasaki, H., et al. Localization of cortical cataract in subjects of diverse races and latitude. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 44, 4210-4214 (2003).
- Söderberg, P. G. Experimental cataract induced by ultraviolet radiation. Acta Ophthalmol. (Copenh. 68, 1-77 (1990).
- Galichanin, K., Löfgren, S., Bergmanson, J., Söderberg, P. Evolution of damage in the lens after in vivo close to threshold exposure to UV-B radiation: cytomorphological study of apoptosis. Exp. Eye Res. 91, 369-377 (2010).
- McCarty, C. A., Taylor, H. R. A review of the epidemiologic evidence linking ultraviolet radiation and cataracts. Dev. Ophthalmol. 35, 21-31 (2002).
- Li, W. C., et al. Lens epithelial cell apoptosis appears to be a common cellular basis for non-congenital cataract development in humans and animals. Journal of Cell Biology. 130, 169-181 (1995).
- Michael, R., Vrensen, G., van Marle, J., Gan, L., Söderberg, P. G. Apoptosis in the rat lens after in vivo threshold dose ultraviolet irradiation. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 13, 2681-2687 (1998).
- Ayala, M. N., Strid, H., Jacobsson, U., Söderberg, P. G. p53 Expression and Apoptosis In The Lens After Ultraviolet Radiation Exposure. Investigative ophthalmology of visual science. 48, 4187-4191 (2007).
- Galichanin, K., Wang, J., Lofgren, S., Soderberg, P. A new universal rat restrainer for ophthalmic research. Acta Ophthalmol. 89 (1), (2011).
- Ayala, M. N., Michael, R., Söderberg, P. G. In vivo cataract after repeated exposure to ultraviolet radiation. Experimental Eye Research. 70, 451-456 (2000).
- Söderberg, P. G., et al. Toxicity of ultraviolet radiation exposure to the lens expressed by maximum tolerable dose (MTD). Developments in Ophthalmology. 35, 70-75 (2002).
- Michael, R. Development and repair of cataract induced by ultraviolet radiation. Ophthalmic Research. 32, 1-45 (2000).
- Löfgren, S. . Cataract from ultraviolet radiation. , (2001).
- Ayala, M. N. . Influence of exposure patterns and oxidation in UVR induced Cataract. , (2005).
- Dong, X. . Safety limit estimation for cataract induced by ultraviolet radiation. , (2005).
- Löfgren, S., Michael, R., Söderberg, P. G. Impact of age and sex in ultraviolet radiation cataract in the rat. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 44, 1629-1633 (2003).
- Ayala, M. N., Michael, R., Söderberg, P. G. Influence of exposure time for UV radiation-induced cataract. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 41, 3539-3543 (2000).
