Purificação por afinidade de Complexos de Influenza Virus ribonucleoproteína da cromatina de células infectadas
Summary
Os vírus da gripe replicar seu genoma de RNA em associação com a célula hospedeira da cromatina. Aqui, apresentamos um método para purificar intactos os complexos de ribonucleoproteínas virais da cromatina das células infectadas. Purificou complexos virais podem ser analisados por Western blot e tanto de extensão do primer de proteína e do conteúdo de ARN, respectivamente.
Abstract
Como todos os vírus de RNA fita negativa-, o genoma dos vírus da gripe é embalado na forma de complexos de ribonucleoproteína virais (vRNP), em que o genoma de cadeia simples é encapsidado pelo nucleoproteína (NP), e associada com o complexo trimérico polimerase consistindo da PA, PB1, PB2 e subunidades. No entanto, em contraste com a maioria dos vírus de ARN, os vírus influenza realizar a síntese de RNA viral nos núcleos das células infectadas. Curiosamente, a síntese de mRNA virai utiliza celulares pré-mRNAs como iniciadores, e tem sido proposto que este processo tem lugar em cromatina 1. As interacções entre a polimerase virai e do hospedeiro a RNA polimerase II, bem como entre NP e nucleossomas hospedeiras foram também caracterizados 1,2.
Recentemente, a geração do vírus da influenza recombinantes que codificam um One-Strep-Tag geneticamente fundido com o terminal C da subunidade PB2 da polimerase virai (rWSN-PB2-Strep 3), seren descrito. Estes vírus recombinantes permitem a purificação de PB2 contendo complexos, incluindo vRNPs, a partir de células infectadas. Para obter purificado vRNPs, culturas de células são infectadas, e vRNPs são purificados por afinidade a partir de lisados derivados a partir destas células. Contudo, os procedimentos de lise utilizadas até à data têm sido baseados em um-passo de lise de detergente, o qual, apesar da presença de uma nuclease geral, muitas vezes extrair cromatina-bound único material de forma ineficiente.
O nosso trabalho preliminar sugeriu que uma grande porção de vRNPs nucleares não foram extraídos durante a lise das células tradicional, e, portanto, não poderia ser purificado por afinidade. Para aumentar este eficiência de extracção, e para separar cromatina-ligado a partir de não-ligados a cromatina vRNPs nucleares, adaptado um passo a passo do protocolo de extracção subcelular para influenza células infectadas por vírus. Resumidamente, este procedimento primeiro separa os núcleos a partir da célula e, em seguida, extrai solúveis proteínas nucleares (aqui denominado "a fracção nucleoplasmic").O material insolúvel remanescente nuclear é então digerido com Benzonase, um DNA inespecífica / RNA nuclease, seguido de dois passos de extracção de sal: em primeiro lugar utilizando 150 mM de NaCl (denominado "CH150"), em seguida, NaCl 500 mM ("ch500") (fig. 1 ). Estes passos de extracção de sal foram escolhidos com base na nossa observação de que 500 mM de NaCl foi suficiente para solubilizar mais de 85% de vRNPs nucleares e ainda assim permitir a ligação de vRNPs etiquetados para a matriz de afinidade.
Após fraccionamento subcelular das células infectadas, é possível purificar afinidade vRNPs pB2-marcados a partir de cada fracção individual e analisar a sua proteína e os componentes de RNA utilizando Western Blot e extensão do iniciador, respectivamente. Recentemente, utilizou este método para descobrir que vRNP exportação formar complexos durante pontos finais após a infecção sobre a fracção de cromatina extraiu-se com 500 mM de NaCl (ch500) 3.
Protocol
Discussion
Enquanto muitos estudos foram recentemente identificadas proteínas individuais ou redes celulares envolvidos na infecção por vírus influenza virus 8, o significado funcional da maioria destas interacções permanece obscura. Dada a dependência absoluta de cromatina funções baseadas para a síntese de RNA vírus influenza e da natureza complexa biofísicas e bioquímicas do núcleo 9, as novas técnicas serão necessários para elucidar estas funções. O fraccionamento subnuclear apresentamo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer Nada Naffakh e Marie-Anne Rameix-Welti (Institut Pasteur) para o vírus rWSN-PB2-Strep.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| DMEM-high glucose | Gibco | 11965-092 | |
| BSA | Sigma | A9418 | |
| Protease inhibitor Mix G | Serva | 39101 | |
| Benzonase Nuclease | Novagen | 71206 | 25 U/μl |
| DNase I, RNase-free | ThermoScientific | EN0523 | 50 U/μl |
| Dounce homogenizer | Wheaton | 432-1271 | Use type “B” pestle |
| Strep-Tactin Sepharose | IBA GmbH | 2-1201-025 | 50% suspension column format can also be used |
| Desthiobiotin | IBA GmbH | 2-1000-002 |
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