Akış Koşullarında İnsan umbilikal ven endotel hücreleri ve nötrofil Transmigration Çalışmaları Kullanılması İzolasyonu
Summary
Bu makale ilk umblikal damarlar, insan endotel hücreleri izole etmek için bir yordam açıklanır ve sonra akış koşullarında nötrofil göçü incelemek için bu hücreleri nasıl kullanılacağını gösterir. Camın optik karakteristikler ile bir polimer elde edilen bir düşük hacimli akış odası kullanılarak, nadir hücre popülasyonlarının canlı-hücre flüoresan görüntüleme da mümkündür.
Abstract
Nötrofiller beyaz kan hücresi en bol türüdür. Bunlar doğuştan gelen bağışıklık sistemi 1 önemli bir parçasını oluştururlar. Akut iltihap süresince, nötrofiller yaralanma siteye geçirmek için ilk enflamatuvar hücreler. Arasında nötrofil üçüncü, haddeleme, yapışma ve hicret, ikinci, mikrovasküler yapısal değişiklikler ve kan dolaşımından plazma proteinlerine kaçmasını önlemek için; bir yaralanma siteye nötrofil alımı kan akışını arttırmak için kan damarları, ilk dilatasyon içeren bir basamaklı bir işlemdir endotel; yaralanma 2,3 yerinde nötrofil ve dördüncü birikimi. In vivo ve in vitro geniş bir dizi bu işlemler 4 çalışma sağlamak için gelişmiştir. Bu yöntem, insan endotel hücreleri arasında nötrofil göçü üzerinde duruluyor.
Nötrofil göçü rol oynayan moleküler süreçleri inceleyerek Bir popüler yöntemi, insan n kullanırbirincil insan umbilikal ven endotel hücreleri (HUVEC) 5 ile etkileşim eutrophils. Nötrofil izolasyon başka bir yerde 6 görsel olarak tarif edilmiştir, dolayısıyla bu makalenin HUVEC izolasyonu için yöntem gösterecektir. Izole edilip birleştiği yetiştirilen, endotel hücreleri yapışma ve aktivasyon moleküllerinin uyarılması sonucu aktive edilir. Örneğin, artan E-selektin ve IL-8 ifadesi 7 TNF-α sonuçları gibi sitokinler ile endotel hücrelerinin aktivasyonu. E-selektin aracılık nötrofiller ve IL-8 aracılık aktivasyonu ve nötrofil firma yapışma yakalama ve haddeleme. Yapışma nötrofiller göçmek sonra. Âlemden (endotelyal hücre kendisi üzerinden) transcellularly paracellularly oluşabilir (endotelyal hücre kavşak aracılığıyla) veya. Çoğu durumda, bu etkileşimlerin damar 7,8 bulundu akış koşullarda oluşur.
Paralel plakalı akışı odası yaygın olarak kullanılan bir sistem olduğunu mihidrodinamik kayma in vivo ve in vitro bulundu 9,10 akış koşullarında nötrofil işe alınma çalışması sağlar. stresleri mikrofon Bazı şirketler paralel plakalı akışı odaları üretmek ve her avantaj ve dezavantajları var. Flüoresan görüntüleme gerekli ise, cam veya optik olarak benzer bir polimerin kullanılması gerekmektedir. Endotel hücreleri cam üzerinde iyi büyümez.
Burada hızlı yapışma ve insan endotel hücrelerinin büyümesini destekler ve karşılaştırılabilir optik niteliklere sahip bir polimer düşük hacimli ibidi kanalı slayt kullanarak nötrofil göçü faz-kontrast, DIC ve floresan görüntüleme için kolay ve hızlı bir yöntem sunmak cam. Bu yöntemde, endotel hücreleri yetiştirildi ve bir ibidi μslide uyarılmış. Nötrofiller akış koşullarında tanıtıldı ve hicret değerlendirildi. Kavşaklarından Floresan görüntüleme karşı paracellular ölçüde gerçek zamanlı belirlenmesi etkintranssellüler âlemden.
Protocol
Discussion
Araştırmacılar rutin nötrofil göçünü ve hicret incelemek için farklı vasküler yatak endotel hücreleri kullandık. Örnekleri arasında, bunlarla dermal mikrovasküler endotel hücreleri 12, insan göbek ven 10 den karaciğer sinüzoidal endotel hücreleri 13 ve endotelyal hücreler, bunlarla sınırlı değildir. Aralarında HUVEC çünkü izolasyon ve durumu kendi göreceli kolaylığı geniş popülerlik kazandı. HUVEC in vivo olarak ortaya çıkan birçok e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Onu teknik yardım için Bayan Lailey;; ve insan kordon sağlamak için Calgary, AB içinde Foothills Hastanesi'nde 51 birim Biz Dr Pina Colarusso görüntüleme ve görüntü analizi ile yardım için Canlı Hücre Görüntüleme Tesis teşekkür ederim. Dr KD Patel bir Alberta yenilikler yaratır şudur: Sağlık Çözümleri Scientist. Bu çalışma, Yenilikçilik ve Alberta Bilim ve Araştırma Kurumu için Kanada Vakfı Sağlık Araştırma ve altyapı ve ekipman hibeleri için Kanada Enstitüleri bir işletme hibesi tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Reagent and Equipment | Company | Catalogue number | Comments |
| Collagenase Type 1 | Worthington | 4197 | |
| Cord buffer | Composition: 140 mM NaCl 4 mM KCl 10 mM D-glucose in 1mM NaH2PO4/Na2HPO4 buffer at pH 7.4 | ||
| Endothelial Cell Media (ECM) | M199 with eagle salts supplemented with 16% human serum containing 100 units of penicillin 100 μg of streptomycin and 0.3 mg of L-glutamine/ml | ||
| M199 | GIBCO | 31100-035 | |
| Penicillin Streptomycin Glutamate (100X) | Invitrogen | 10378-016 | |
| Ibidi chambers | Ibidi | 80606 | |
| TNF-α | Prepro Tech | 300-01A | |
| Human Albumin 20% solution | Gemini Bioproducts | 800120050 | |
| HBSS without Ca2+ and Mg2+ | Sigma | H2487-10X | |
| HBSS with Ca2+ and Mg2+ | Sigma | H1387-10X |
References
- Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nat. Rev. Immunol. 6, 173-182 (2006).
- Diacovo, T. G. Neutrophil rolling, arrest, and transmigration across activated, surface-adherent platelets via sequential action of P-selectin and the beta 2-integrin CD11b/CD18. Blood. 88, 146-157 (1996).
- Ley, K. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat. Rev. Immunol. 7, 678-689 (2007).
- Petri, B. Endothelial LSP1 is involved in endothelial dome formation, minimizing vascular permeability changes during neutrophil transmigration in vivo. Blood. 117, 942-952 (2011).
- Chavakis, T. The junctional adhesion molecule-C promotes neutrophil transendothelial migration in vitro and in vivo. J. Biol. Chem. 279, 55602-55608 (2004).
- Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil Isolation Protocol. J. Vis. Exp. (17), e745 (2008).
- Liu, Y. Regulation of leukocyte transmigration: cell surface interactions and signaling events. J. Immunol. 172, 7-13 (2004).
- Alcaide, P. Neutrophil recruitment under shear flow: it’s all about endothelial cell rings and gaps. Microcirculation. 16, 43-57 (2009).
- Jutila, M. A. Measurement of neutrophil adhesion under conditions mimicking blood flow. Neutrophil Methods and Protocols. 412, 239-256 (2007).
- Cuvelier, S. L., Patel, K. D. Studying leukocyte rolling and adhesion in vitro under flow conditions. Basic Cell Culture Protocols. 290, 331-342 (2005).
- Wiese, G., Barthel, S. R., Dimitroff, C. J. Analysis of Physiologic E-Selectin-Mediated Leukocyte Rolling on Microvascular Endothelium. J. Vis. Exp. (24), e1009 (2009).
- Petzelbauer, P. Heterogeneity of dermal microvascular endothelial cell antigen expression and cytokine responsiveness in situ and in cell culture. J. Immunol. 151, 5062-5072 (1993).
- Bonder, C. S., Kubes, P. Modulating leukocyte recruitment to splanchnic organs to reduce inflammation. Am J Phys – Gastrointestinal and Liver Phys. 284, G729-G733 (2003).
- Cuvelier, S. L. Eosinophil adhesion under flow conditions activates mechanosensitive signaling pathways in human endothelial cells. J. Exp. Med. 202, 865-876 (2005).
- Massia, S. P., Hubbell, J. A. Human endothelial cell interactions with surface-coupled adhesion peptides on a nonadhesive glass substrate and two polymeric biomaterials. J. Biomed. Mat. Res. 25, 223-242 (1991).
