Imuno-histoquímica para Topografia Wholemount cerebrais, Complexo

Summary

Circuitos neurais são topograficamente organizados em compartimentos funcionais específicas com perfis moleculares. Aqui, apresentamos os passos práticos e técnicos para revelar topografia cérebro global usando uma abordagem de coloração imuno-histoquímica wholemount versátil. Nós demonstrar a utilidade do método utilizando o citoarquitetura bem compreendida e os circuitos de cerebelo.

Abstract

A arquitetura repetida e bem-entendido celular do cerebelo torná-lo um sistema modelo ideal para explorar a topografia do cérebro. Subjacente a sua citoarquitetura relativamente uniforme é um complexo conjunto de domínios parassagitais de expressão gênica e protéica. A compartimentação molecular do cerebelo é espelhada pela organização anatômica e funcional das fibras aferentes. Para apreciar plenamente a complexidade da organização do cerebelo que anteriormente uma abordagem refinada coloração wholemount para análise de defeitos de alto rendimento de padronização no cerebelo mouse. Este protocolo descreve em detalhes os reagentes, instrumentos e medidas práticas que são úteis para o sucesso revelar padrões de expressão de proteínas no cerebelo do rato adulto usando imunomarcação wholemount. Os passos em destaque aqui demonstrar a utilidade do presente método utilizando a expressão de zebrinII / aldolaseC como um exemplo de como a topografia fina do cérebro pode ser revelado na suaconformação tridimensional nativa. Também descritos são adaptações para o protocolo que permite a visualização de expressão da proteína em projeções aferentes e cerebelo grande para estudos comparativos de topografia molecular. Para ilustrar estas aplicações, os dados de coloração aferente do cerebelo de rato estão incluídos.

Protocol

1. Perfusão Animal e Dissection Cerebelo Dependendo da proteína, a perfusão pode ser essencial para 1,2 coloração bem sucedida. Perfusão intracardíaca é um procedimento invasivo, o procedimento não-sobrevivência que exige o uso adequado de anestésicos. Treinamento correto, aprovação institucional, e aprovação IACUC são todos necessários antes de tentar o procedimento. É sempre uma boa idéia consultar veterinários da instituição para obter ajuda na identificação de requisitos…

Discussion

Nós descrevemos os detalhes técnicos necessários para a coloração wholemount sucesso utilizando uma abordagem versátil imuno-histoquímica para expressão da proteína reveladora no cérebro em desenvolvimento e adultos. Usando esta abordagem, complexos moleculares padrões de expressão podem ser analisadas e topografia cérebro apreciado sem a necessidade de trabalhoso e demorado procedimentos de secção consumindo de tecidos.

Este protocolo foi usado para revelar a expressão padro…

Materials

Materials	Function in protocol
Perfusion pump (Fisher Scientific/13-876-2)	Allows for consistent and slow perfusion.
Sharp-tip Scissors (FST/14081-08)	General use in perfusion and dissection.
Blunt-tip Forceps (FST/91100-12)	To stabilize the heart for insertion of the perfusion needle.
Forceps (FST by Dumont AA/11210-10)	For use during dissection of the brain from the skull and to separate the cerebellum from the rest of the brain. These are essential because they have a slightly rounded tip that helps minimize damage to the cerebellum during dissection.
Nutator (Fisher Scientific)	Used to keep tissue in motion during incubation periods.
1.5 mL tube (Sarstedt/Screw Cap Micro Tube)	All steps of the histochemistry protocol take place in these microtubes. The rounded bottom ensures that the cerebellum stays in motion.
Perforated spoon (FST/10370-17)	Used to keep wholemounts in the microtubes while gently decanting out the spent solution.
Leica MZ16 FA microscope	Used to examine wholemount staining.
Leica DFC3000 FX camera	Used to capture wholemount images.

Table 1.

Example calendar for a typical wholemount experiment
Day 1	Dent’s fix, room temperature, 8 hrs				Dent’s bleach, 4°C, overnight
Day 2	100% MeOH, room temperature, 2x, 30 min each			100% MeOH, Freeze/thaw, 4x, 30 min/15 min			100% MeOH, -80°C, overnight
Day 3	50% MeOH/50% PBS, room temperature, 60-90 min	15% MeOH/ 85% PBS, room temperature, 60-90 min		100% PBS, room temperature, 60-90 min		10μg/mL Proteinase K in PBS, room temperature, 2-3 min	100% PBS, room temperature, 3x, 10 min each	PMT, 4°C, overnight
Day 4-5	PMT + 1° antibody + 5% DMSO, 4°C, 48 hrs
Day 6	PMT, 4°C, 2-3x, 2-3 hrs each			PMT + 2° antibody + 5% DMSO, 4°C, 24 hours (Or begin amplification steps with ABC complex)
Day 7	PMT, 4°C, 2-3x, 2-3 hrs each		PBT, room temperature, 2 hrs			Incubate in fresh DAB in PBS until optimal staining is visualized

Table 2.

Recipes (*=prepare fresh every time)
PBS (phosphate buffered saline)	0.1M phosphate buffered saline in deionized water. pH 7.2 (Sigma tablets; P4417)
PFA (Paraformaldehyde)	Made and stored frozen as a 20% solution and then diluted to 4% in PBS for the working solution (Fisher Scientific; T353)
Dent’s Fixative3*	4 parts methanol 1 part dimethylsulfoxide (DMSO; Fisher Scientific; D159-4)
Dent’s Bleach3*	4 parts methanol 1 part dimethylsulfoxide (DMSO; Fisher Scientific; D159-4) 1 part 30% hydrogen peroxide
Enzymatic Digestion	10 μg/ml of Proteinase K (Roche Diagnostics; 03115828001) in PBS.
PBST	PBS containing: 0.1% Tween-20 (Fisher Scientific, BP337; Triton can also be used in place of Tween-20 in all instances.)
PMT25*	PBS containing: 2% nonfat skim milk powder (Carnation preferred) 0.1% Tween-20 (Fisher Scientific; BP337)
PBT25*	PBS containing: 0.2% bovine serum albumin (Sigma; B9001S) 0.1% Tween-20 (Fisher Scientific; BP337)
DAB*	Dissolve one 10-mg tablet of 3,3-diaminobenzidine (Sigma-Aldrich; D5905) in 40 ml of PBS. Add 10 μl of 30% hydrogen peroxide to initiate reaction).
ABC Complex Solution	Vectastain kit (Vector laboratories, Inc; PK-4000)

Table 3.